胡桃醌通過調節NF-κB/Snail通路抑制卵巢癌細胞上皮間質轉化

鞠曉紅，徐海月，李 強，陳 爽，方 芳 (吉林醫藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013)

卵巢癌是常見的惡性生殖器腫瘤，極易發生侵襲轉移，初診時75%的患者已屬于晚期[1]。上皮-間質轉化(epithelial-to-esenchymal transition,EMT)是指上皮細胞在正常生理和特定病理情況下向間質轉化的現象，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得間質表型，使細胞獲得較高的遷移與侵襲能力[2]。目前，臨床針對卵巢癌的治療主要采用手術治療聯合鉑類化療作為治療手段，但是發生耐藥是卵巢癌治療失敗的重要因素[3]。因此，尋找有效治療卵巢癌的藥物至關重要。胡桃醌是從核桃楸中提純的一種天然成分，具有抗腫瘤的作用。前期研究結果表明，胡桃醌具有抑制卵巢癌SKOV3細胞黏附和侵襲作用[3]，是否胡桃醌具有抑制卵巢癌細胞EMT的作用還不清楚。本研究利用胡桃醌作用卵巢癌細胞，明確胡桃醌對卵巢癌細胞的EMT作用，并探討其作用機制，積極發現抑制卵巢癌細胞EMT的有效藥物，對于提高卵巢癌的療效十分重要。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人卵巢癌SKOV3細胞購自上海中科院細胞庫；胡桃醌(美國Sigma公司)；兔抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、Snail、NF-κB p65、β-actin和Histon H抗體和NF-κB通路抑制劑PDTC(美國Cell Signaling Technology公司)。細胞培養箱(美國Thermo Forma公司)；Western blotting系統(美國BIO-RAD公司)；生物顯微鏡(日本Olympus公司)；凝膠成像系統(美國BioRad公司)。

1.2 細胞培養

將人卵巢癌細胞SKOV3細胞培養于含10%胎牛血清IMDM培養液中，隔日換液，選擇生長狀態良好的對數期細胞進行實驗。

1.3 細胞劃痕法檢測細胞遷移率

細胞接種于6孔細胞培養板，待細胞匯合率達80%左右時，用滅菌的200 μL槍頭垂直均勻地劃出1條筆直的無細胞的劃痕；PBS洗2次，然后根據前期實驗結果的IC50值選擇加入20 μmol/L胡桃醌培養液[5]，以減少由于藥物引起的細胞凋亡造成對實驗的影響。同時設陰性對照孔，顯微鏡下記錄位置并拍照，記該點為0 h。37 ℃，5%CO2條件下繼續培養24 h；取出6孔細胞培養板，顯微鏡下原位點拍照，記該點為24 h。使用Image J軟件分析每個圖片無細胞區域面積，劃痕閉合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/(0 h劃痕面積)×100%，重復3次。

1.4 免疫印跡法檢測EMT相關蛋白及NF-κB-p65和Snail的表達

終濃度為20 μmol/L胡桃醌作用細胞24 h，加入細胞裂解液，用細胞刮器刮取細胞，4 ℃超聲裂解細胞，分別提取細胞總蛋白和細胞核蛋白，收集上清液測蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE，并轉移到PVDF膜上。室溫下PVDF膜在封閉緩沖液中2 h，加兔抗E-cadherin、N-cadherin、NF-κB-p65、Snail抗體(1∶1000)、β-actin和Histon H抗體(1∶4000)4 ℃過夜。次日TBST洗膜，分別加HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶4000)，室溫避光孵育2 h。TBST洗膜，加底物發光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

1.5 統計方法

應用SPSS17.0軟件進行數據分析，組間差異比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 胡桃醌對SKOV3細胞遷移率影響

與對照組劃痕閉合率(74.4±9.2)%比較，胡桃醌作用細胞后更少的細胞向劃痕中央聚集，劃痕閉合率為(40.6±4.7)%，差異有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

陰性對照組 胡桃醌組

2.2 胡桃醌對SKOV3細胞EMT相關蛋白表達影響

結果顯示，對照組和20 μmol/L胡桃醌作用細胞24 h后E-cadherin表達分別是(0.31±0.04)和(0.45±0.05)；N-cadherin表達分別是(0.44±0.03)和(0.22±0.02)。與對照組比較，胡桃醌組的E-cadherin表達升高(P<0.05)、N-cadherin表達降低(P<0.01)。

陰性對照組 胡桃醌組

圖 2 胡桃醌對SKOV3細胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達影響

2.3 胡桃醌通過NK-κB途徑抑制SKOV3細胞EMT

Western blotting檢測陰性對照組和胡桃醌組細胞NK-κB p65和Snail的表達。結果表明，陰性對照組的NF-κB p65和Snail的表達分別是(0.84±0.04)和(0.43±0.03)；胡桃醌組NF-κB p65和Snail的表達分別是(0.57±0.02)和(0.21±0.03)。與陰性對照組比較，胡桃醌組的NF-κB p65和Snail的表達下降(P<0.05，P<0.01)(圖3)。表明胡桃醌可能通過NF-κB信號途徑抑制SKOV3細胞的EMT作用。

為了進一步證實NF-κB信號通路參與胡桃醌抑制SKOV3細胞的EMT作用，NF-κB途徑抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯10 μmol/L(PDTC)與胡桃醌作用，Western blotting檢測Sanil的表達。結果顯示，與胡桃醌組Snail蛋白表達(0.62±0.02)比較，胡桃醌與PDTC聯合作用細胞后Snail蛋白表達(0.1±0.01)下降(P<0.01)(圖4)。

陰性對照組 胡桃醌組

圖 3 胡桃醌對SKOV3細胞NF-κB p65和Snail蛋白表達影響

圖 4 PDTC促進胡桃醌抑制Snail蛋白表達

3 討 論

腫瘤轉移是復雜過程。其中，腫瘤細胞脫離原發病灶并獲得侵襲能力是腫瘤轉移的第一環節。EMT是指上皮細胞向間質轉化的現象。間質表型能增加細胞遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力。EMT的發生伴隨上皮標志物E-cadherin、緊密連接蛋白ZO-1、β-連環素等表達下調；間質標志物波形蛋白、N-cadherin等表達上調。其中E-cadherin的表達下降在EMT的發生中至關重要[6]。胡桃醌是從核桃楸中提純的一種天然成分，具有抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的功能[7-8]。本研究結果表明，胡桃醌作用卵巢癌SKOV3細胞可以抑制細胞遷移、使E-cadherin表達升高而N-cadherin表達下降的作用,表明胡桃醌具有抑制卵巢癌SKOV3細胞EMT的作用。

EMT的調控機制復雜，多種生長因子、轉錄因子和信號通路參與EMT的調節，其中Snail是重要調節EMT的轉錄因子。Snail可以結合到E-cadherin基因的啟動子近端部位的E-box序列，進而抑制其表達水平，從而導致EMT現象的發生[9]。NF-κB作為轉錄因子與腫瘤的發生、生長和轉移等多個過程密切相關。P65是NF-κB一個亞基，其激活后由細胞質進入細胞核，具有促進細胞增殖和抑制凋亡等作用[10]。NF-κB信號通路是卵巢癌細胞促進化療耐藥、腫瘤細胞轉移和免疫逃逸的主要掌控者[11]。Snail作為重要的EMT轉錄因子可以被NF-κB調節。NF-κB可以作用在Snail的啟動子區增加Snail的轉錄[12]。本研究結果表明，胡桃醌能夠抑制SKOV3細胞NF-κB p65和Snail表達。

為了進一步驗證胡桃醌通過NF-κB途徑抑制卵巢癌細胞EMT的作用，研究使用了NF-κB途徑激活劑PDTC處理SKOV3細胞。結果發現，PDTC能夠進一步抑制Snail蛋白的表達。

綜上所述，本研究發現胡桃醌可能通過抑制NF-κB/Snail信號通路降低卵巢癌細胞EMT的發生，從而減少卵巢癌細胞侵襲。本研究明確胡桃醌抑制卵巢癌細胞侵襲轉移作用，為卵巢癌的臨床研究和治療提供一定的理論基礎。