肺炎克雷伯菌在某院醫(yī)院內(nèi)感染中的分布及耐藥性分析

肖啟國(guó)，湯美華

湖南省衡陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南衡陽(yáng) 421001

肺炎克雷伯菌作為一種常見(jiàn)的病原體類型，廣泛分布于人體皮膚、鼻咽部、呼吸道、腸道及自然界的水土中[1]。肺炎克雷伯菌常定植于人體呼吸道與腸道，可通過(guò)侵入性操作侵犯?jìng)诤兔谀虻蓝鸶腥荆?dāng)人體免疫力降低時(shí)，可以引起較為嚴(yán)重的感染，甚至敗血癥[2-4]。近年來(lái)，由于各類廣譜抗菌藥物大量應(yīng)用于臨床，同時(shí)激素、免疫抑制劑的使用也在不斷增多，特別是第三代頭孢菌素的廣泛使用，使細(xì)菌在藥物的選擇壓力下獲得多重耐藥性等，且隨著產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)菌株的出現(xiàn)，細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)峻[5]。對(duì)于ESBLs腸桿菌科細(xì)菌感染的治療，目前臨床中主要是應(yīng)用碳青霉烯類抗菌藥物，臨床療效顯著，但最近，腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶(KPC)在國(guó)內(nèi)外的報(bào)道越來(lái)越多[6-7]。對(duì)于臨床分離的肺炎克雷伯菌，主要是產(chǎn)頭孢菌素酶(AmpC)、KPC及ESBLs。本研究對(duì)本院分離的多重耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥性進(jìn)行分析，旨在對(duì)臨床合理用藥產(chǎn)生指導(dǎo)性意義，并對(duì)此種細(xì)菌在醫(yī)院內(nèi)的感染加以有效控制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 2015年1月至2016年12月來(lái)自臨床住院患者痰、咽拭子、尿液、血液等標(biāo)本分離的286株肺炎克雷伯菌。

1.2儀器與試劑 TDR-300B微生物鑒定分析儀，比濁儀，ESBLs檢測(cè)試劑盒，MH瓊脂平板，OXOID藥敏紙片，游標(biāo)卡尺，離心機(jī)，三洋低溫冰箱MDFU32V。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)和最低抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)檢測(cè)肺炎克雷伯菌對(duì)阿米卡星(AK)、慶大霉素(CN)、氨芐西林(AMP)、氨芐西林/舒巴坦(SAM)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、妥布霉素(TOB)、亞胺培南(IMP)、頭孢曲松(CRO)、頭孢唑啉(KZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢西丁(FOX)、氨曲南(ATM)、復(fù)方磺胺甲噁唑(SXT)、洛美沙星(LOM)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)等藥物的耐藥性。判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)(2014年版)的規(guī)定。

1.3.2ESBLs表型篩選與確證試驗(yàn) 篩選出藥敏試驗(yàn)中抑菌環(huán)直徑CAZ≤22 mm或CTX≤27 mm或CRO≤25 mm或ATM≤27 mm的菌株為疑產(chǎn)ESBLs株。對(duì)疑產(chǎn)ESBLs菌株再采用K-B法進(jìn)行確證試驗(yàn),使用每片含30 μg CAZ、CTX紙片和頭孢他啶/克拉維酸(CAC，30 μg/10 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTC，30 μg/10 μg)復(fù)合紙片進(jìn)行試驗(yàn)，當(dāng)任何一種復(fù)合藥敏紙片抑菌圈直徑與其單獨(dú)藥敏紙片抑菌圈直徑之差≥5 mm,即可確認(rèn)為產(chǎn) ESBLs株。

1.3.3KPC表型篩查試驗(yàn) 采用K-B法，根據(jù)CLSI(2014年版)標(biāo)準(zhǔn)，美羅培南(MEM，10 μg)或IMP(10 μg)抑菌圈直徑≤22 mm為表型篩查陽(yáng)性。

1.3.4產(chǎn)新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(NDM-1)表型確診試驗(yàn) 雙紙片協(xié)同試驗(yàn)采用IMP(10 μg)或MEM(10 μg)/乙二胺四乙酸(EDTA,1 500 μg)兩種紙片(K-B法)，兩紙片距離10～15 mm，在含EDTA紙片方向處，MEM或IMP抑菌圈直徑擴(kuò)大，即可判定產(chǎn)NDM-1；組合紙片法采用IMP(10 μg)或MEM(10 μg)/EDTA復(fù)合紙片進(jìn)行K-B法試驗(yàn)，復(fù)合紙片比單藥紙片的抑菌圈直徑增大值為≥5 mm，即可判定產(chǎn)NDM-1。

1.3.5改良霍奇試驗(yàn) 制備好0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希菌ATCC25922菌懸液，然后將菌懸液進(jìn)行10倍稀釋，并使用棉簽將其均勻地涂布于MH平板中，然后在平板中央貼含10 μg MEM的紙片。使用接種環(huán)挑取受試菌自紙片邊緣向平板邊緣劃線接種。35 ℃孵育過(guò)夜，如果矢狀生長(zhǎng)存在于MEM抑菌圈與待測(cè)菌株接種線交界處，則說(shuō)明產(chǎn)KPC呈陽(yáng)性。

1.3.6AmpC表型篩選及確認(rèn) 采用FOX紙片使用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)臨床分離菌株。當(dāng)抑菌圈直徑≤18 mm時(shí),說(shuō)明對(duì)FOX產(chǎn)生耐藥或中介，可能為產(chǎn)AmpC菌株,提示AmpC表型篩選呈現(xiàn)陽(yáng)性。AmpC的確認(rèn)試驗(yàn)：FOX三維確認(rèn)試驗(yàn)是檢測(cè)AmpC的經(jīng)典方法，在涂布了0.5麥?zhǔn)蠞岫却竽c埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的平板上貼FOX紙片，向離心方向使用無(wú)菌刀片切一裂隙，距紙片邊緣5 mm處，將30～40 μL的待檢菌株β-內(nèi)酰胺酶初提液(過(guò)濾或低溫超速離心除去活菌)加入裂縫中，并防止酶初提液溢出裂隙，進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，溫度在35 ℃，如果細(xì)菌生長(zhǎng)于抑菌圈內(nèi)裂隙旁，則說(shuō)明產(chǎn)AmpC陽(yáng)性。采取反復(fù)凍融法進(jìn)行粗酶提取。

1.3.7質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌 ATCC25922及肺炎克雷伯菌 ATCC700603。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用WHONET5.4軟件，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLs的耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本分布 286株肺炎克雷伯菌主要分離自痰(228株，79.72%)、尿液(25株，8.74%)、傷口分泌物(16株，5.59%)。見(jiàn)表1。

2.2科室分布 286株肺炎克雷伯菌主要分布在ICU(56.29%)，呼吸內(nèi)科(27.62%)，見(jiàn)表2。

2.3藥敏試驗(yàn)比較 分離的286株肺炎克雷伯菌中，產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌162株，檢出率為56.64%，其耐藥率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 肺炎克雷伯菌株標(biāo)本類型分布構(gòu)成比(%)

表2 肺炎克雷伯菌株在各科室分布構(gòu)成比(%)

表3 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株耐藥率(%)

續(xù)表3 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌株耐藥率(%)

2.4耐藥表型分析 本研究286株肺炎克雷伯菌中產(chǎn)ESBLs菌株162株，檢出率為56.64%；產(chǎn)AmpC酶菌株39株，檢出率為13.64%；產(chǎn)KPC酶菌株28株，檢出率為9.79%；產(chǎn)NDM-1菌株2株，檢出率為0.70%。

3 討 論

作為引起呼吸道感染為主要醫(yī)院內(nèi)感染的一種常見(jiàn)致病菌，肺炎克雷伯菌多造成肺、創(chuàng)面、泌尿系統(tǒng)及血液等的感染，導(dǎo)致患者出現(xiàn)菌血癥、肺炎及尿路感染等。本研究對(duì)分離的286株來(lái)自臨床患者的肺炎克雷伯菌進(jìn)行分析，分離自痰和咽拭子的標(biāo)本占81.47%，且臨床分布主要在ICU和呼吸內(nèi)科，表明該菌主要引起呼吸道感染，與文獻(xiàn)報(bào)道較一致[8-9]。肺炎克雷伯菌由于受到抗菌藥物廣泛使用的影響，其耐藥菌株呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢(shì)。在本研究中，肺炎克雷伯菌的耐藥性主要體現(xiàn)在第二代頭孢菌素中，與此同時(shí)，對(duì)第三代頭孢菌素及第四代頭孢菌素的耐藥性也在持續(xù)增加，但是對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物(如IMP和MEM)的耐藥率相對(duì)較低，但有逐年增高的趨勢(shì)[10-11]。本研究檢出產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌28株，檢出率9.79%，應(yīng)引起臨床醫(yī)生的重視，而造成此結(jié)果的主要原因可能是受到第三代頭孢菌素和IMP/西司他丁鈉應(yīng)用于呼吸內(nèi)科及ICU的影響，此次標(biāo)本結(jié)果中共有產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌患者2例，為防止該基因的擴(kuò)散流行，臨床及感控部門(mén)應(yīng)引起重視。

由于第三代頭孢菌素在臨床中廣泛使用，產(chǎn)ESBLs及高產(chǎn)AmpC的革蘭陰性桿菌在持續(xù)增加,而且臨床中廣泛應(yīng)用碳青霉烯類藥物(如IMP),因此造成產(chǎn)KPC的肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌的不斷出現(xiàn)，同時(shí)產(chǎn)NDM-1的肺炎克雷伯菌也被檢出，多重耐藥和泛耐藥的革蘭陰性桿菌在臨床不斷被檢出，并且面臨著世界性流行，成為嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，引起國(guó)內(nèi)外衛(wèi)生組織的廣泛關(guān)注。

將產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥性作為本次研究的重要分析內(nèi)容，在耐藥性方面，產(chǎn)ESBLs明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株。作為肺炎克雷伯菌的多重耐藥機(jī)制，產(chǎn)ESBLs的菌株能夠?qū)V譜青霉素和第一、二、三代頭孢菌素產(chǎn)生分解作用，與此同時(shí)甚至能夠水解第四代頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，其對(duì)氨基糖苷類及喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性也相對(duì)較高。本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌菌株中對(duì)含酶抑制劑的復(fù)合抗菌藥物SAM耐藥率高達(dá)95.06%，說(shuō)明SAM已經(jīng)不適應(yīng)于臨床對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株引起感染的治療，TZP耐藥率相對(duì)較低，但也有20.99%。本研究中，產(chǎn)AmpC檢出率為13.64%(39株)，其中12株同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC菌株直接影響了復(fù)合抗菌藥物(含酶抑制劑)對(duì)產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的臨床治療效果，但是產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)IMP等碳青霉烯類抗菌藥物具有較高的敏感性，臨床上仍可直接用于治療產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌引起的重度感染。

本研究結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌檢出率為56.64%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的結(jié)果相近[12]，表明本院也普遍存在較為嚴(yán)重的ESBLs菌株流行，其耐藥機(jī)制主要包括：抗菌藥物滲透障礙、改變抗菌藥物作用靶點(diǎn)、產(chǎn)生抗菌藥物主動(dòng)外排機(jī)制、產(chǎn)生抗菌藥物滅活酶并在菌種間經(jīng)多種途徑進(jìn)行耐藥基因的傳播。抗菌藥物在醫(yī)院、社區(qū)濫用是產(chǎn)生ESBLs耐藥菌株的重要原因，為降低產(chǎn)ESBLs菌株的發(fā)生率，應(yīng)加強(qiáng)控制抗菌藥物的使用，抑制耐藥菌株的流行，建立細(xì)菌耐藥檢測(cè)體系，及時(shí)開(kāi)展快速檢測(cè)產(chǎn)ESBLs、NDM-1、AmpC及KPC，確保為抗菌藥物在臨床中的合理使用提供更直接、更有效的證據(jù)，以指導(dǎo)臨床合理用藥，控制多重耐藥菌株的產(chǎn)生與傳播，防止耐藥株產(chǎn)生，引發(fā)醫(yī)院內(nèi)感染。