耐碳青霉烯酶腸桿菌科細菌血流感染的基因分析

陳建平，朱 菁，黃 旭，梅亞寧

1.江蘇省南京市六合區人民醫院檢驗科，江蘇南京 211500；2.南京醫科大學附屬兒童醫院檢驗科，江蘇南京 210029;3.南京醫科大學第一附屬醫院/江蘇省人民醫院檢驗學部，江蘇南京 210029

在我國，腸桿菌科細菌感染不斷增加，已成為醫院內感染的主要病原菌，其導致的血流感染也逐年增加。引起血流感染的腸桿菌科細菌有大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產酸克雷伯菌、產氣腸桿菌等，其中以大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌感染最常見[1-2]。這類菌株易出現耐藥菌株，尤其是耐碳青霉烯酶的菌株，其導致的血流感染嚴重且預后較差[3]。本文收集2016年1-12月南京醫科大學第一附屬醫院住院患者血流感染中分離無重復的亞胺培南和(或)美羅培南耐藥的菌株，并對其進行碳青霉烯酶的檢測，了解這些菌株相關耐藥基因攜帶和藥物敏感性，為臨床治療提供依據。現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 采用WHONET5.6軟件，收集2016年1-12月南京醫科大學第一附屬醫院住院患者血流感染共分離到的16株耐碳青霉烯酶菌。其中4株為大腸埃希菌，12株為肺炎克雷伯菌。質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。收集研究菌株對應患者的基本資料，包括年齡、科室、臨床診斷、抗菌藥物使用時間、入院到分離耐碳青霉烯酶腸桿菌科細菌(CRE)時間、侵入性操作、治療藥物、轉歸。研究菌株編號1-16，分別對應菌株保存編號X020E6、X008C6﹑X011A9﹑X008F5﹑X016D4、X009J5、X009H5、X010F7、X015C8、X010E2、X010F1、X009A5、X015B9、X021C4、X021E4、X017G1。

1.2儀器與試劑 美羅培南、亞胺培南、氨曲南等為中國藥品生物制品檢定所產品，替加環素E-test條、藥敏紙片、MH瓊脂、MH肉湯為英國Oxoid公司產品，GNI細菌檢定卡和VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀為法國生物梅里埃公司產品，PCR檢測試劑盒和DNA Marker為武漢谷歌生物科技有限公司產品。

1.3方法

1.3.1CRE初篩 用Vitek2-Compact全自動細菌鑒定儀對血流感染中的CRE進行初篩。

1.3.2改良Hodge試驗 參照2016年美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)M100-S26文件中腸桿菌科菌產碳青霉烯酶的改良Hodge試驗進行[4]。

1.3.3耐藥酶基因檢測 耐藥酶基因檢測采用PCR法，引物序列和擴增產物長度見表1。實驗方法參考文獻[5]。

1.3.4微量肉湯稀釋法 用微量肉湯稀釋法檢測16株菌株對美羅培南、亞胺培南、多黏菌素、替加環素、氨曲南的敏感性，判讀及結果解釋參照2016年美國CLSI M100-S26文件進行。替加環素采用美國食品藥品管理局(FDA)推薦的解釋標準進行判讀，最低抑菌濃度(MIC)≤2.0 mg/L為敏感，4.0 mg/L為中介，MIC≥8.0 mg/L為耐藥。

2 結 果

2.1患者高危因素 16株研究菌株患者年齡大于60歲的占 87.50%(14/16),重癥監護病房(ICU)患者占43.75%(7/16)，長期使用抗菌藥物患者占68.75%(11/16)，長期住院患者占56.25%(9/16),有侵入性操作治療患者占68.75%(11/16)。見表2。

表1 引物序列和產物

2.2改良Hodge試驗結果 16株菌株進行改良Hodge試驗，12株肺炎克雷伯菌改良Hodge試驗陽性，4株大腸埃希菌中有2株改良Hodge試驗為陽性，2株為陰性。

2.3耐藥基因檢測結果 耐藥基因的檢測結果見圖1。16株CRE菌株的耐藥基因均為肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC-2)基因。

注：M為DNA Marker;泳道1-16為目的基因。

圖1 KPC-2基因擴增產物電泳圖

注：-表示未使用抗菌藥物。

2.4微量肉湯稀釋法結果 用微量肉湯稀釋法檢測16株CRE對抗菌藥物的敏感性，結果顯示，16株菌株對美羅培南、亞胺培南、氨曲南耐藥，對多黏菌素，替加環素敏感。見表3。

表3 16株菌株抗菌藥物MIC值(mg/L)

3 討 論

腸桿菌科細菌是社區和醫院獲得性感染中最常見的病原菌，可引起下呼吸道、消化道、泌尿道、血液、手術切口等多種部位感染。有研究報道，在院內血流感染中前3位的病原菌依次為大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌[6]。目前，KPC-2基因型酶在我國的浙江、上海、江蘇、湖南、北京、山東等多省市均有報道,其中長江三角洲地區報道最多[7]。本研究中，16株可疑產碳青霉烯類菌均含KPC-2基因，表明KPC-2是南京醫科大學第一附屬醫院血流感染患者耐碳青霉烯酶腸桿菌科的主要基因型，與以往文獻報道相似[8]。醫務人員應對CRE菌株的傳播與感染提高警惕，盡早采取措施監測患者感染菌的耐藥情況，加強對此類患者的管理，減少其與其他患者接觸的機會，切斷感染途徑。

耐碳青霉烯酶腸桿菌科的臨床治療一直是個難題，CRE幾乎對所有β-內酰胺抗菌藥物耐藥，同時攜帶有其他耐藥機制，對氨基糖苷、喹諾酮類也耐藥，對多黏菌素和替加環素具有較高的體外敏感性[7]，這與本研究中藥敏結果一致。我國廣泛耐藥革蘭陰性菌感染診治專家共識建議使用以多黏菌素和(或)替加環素為基礎的聯合用藥方案治療CRE細菌感染[9]。本研究中，有替加環素聯合亞胺培南治療，也有亞胺培南單獨治療，還有美羅培南聯合左氧氟沙星治療，臨床均顯示預后良好。

CRE引起的感染對患者威脅越來越大，目前缺乏確認有效的治療藥物，所以醫院內感染控制顯得尤為重要。有研究表明，CRE的易感因素有疾病危重、入住ICU、長期使用抗菌藥物、有侵入性操作等[7]。本研究中的CRE病例7株分布在ICU，概率為43.75%，其他病例也主要分布在外科，這與以往文獻報道一致[10]。面對CRE的威脅，醫療機構應了解患者感染CRE的危險因素，采取相應的干預措施，包括手衛生、接觸隔離、醫務人員培訓、最低限度使用侵入性操作、檢出CRE時實驗室及時通知醫護人員、促進抗菌藥物管理、保持環境衛生等[11]。

CRE的血流感染給患者治療帶來了極大的困難，同時也給醫院內感染防控提出了挑戰。CRE的處理要從整體、全局出發，注重抗菌藥物合理使用、病原菌檢測、耐藥菌監測、患者管理等[12]。因此，加強CRE的監測，嚴格執行抗菌藥物合理使用的管理規定，同時加強醫院內感染預防與控制，避

免CRE在院內傳播和不斷演變。