環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)便捷檢測(cè)淋病奈瑟菌porA基因

向 波，向 輝，易 平，劉龍亞，印道春，田 芳，符自清△

吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院/湘西州人民醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.腫瘤科；3.泌尿外一科；4.皮膚科，湖南吉首 416000

淋病是由淋病奈瑟菌(NG)引起的性傳播性疾病。NG是國(guó)家法定監(jiān)控的細(xì)菌之一，盡管淋病發(fā)病率高，但全國(guó)NG檢出率低[1-3]。目前，臨床醫(yī)生診斷淋病的重要依據(jù)是泌尿生殖系統(tǒng)的流膿癥狀,以及涂片發(fā)現(xiàn)革蘭陰性雙球菌。該方法診斷男性淋病患者具有一定準(zhǔn)確性，但不適用于診斷淋病性宮頸炎和淋病性盆腔炎的女性患者。盡管各大醫(yī)院普遍開(kāi)展了NG分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，然而國(guó)內(nèi)女性淋病患者的陽(yáng)性檢出率一直處于較低水平[3-4]。這是由于女性患者感染癥狀不明顯，以及臨床醫(yī)師和檢驗(yàn)技師的一系列錯(cuò)誤認(rèn)識(shí)和不當(dāng)操作共同導(dǎo)致。因此，臨床迫切需要研發(fā)一種更高效的檢測(cè)系統(tǒng)，用于提高女性淋病患者陽(yáng)性檢出率。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)是2000年開(kāi)發(fā)出來(lái)的一種比傳統(tǒng)分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)更簡(jiǎn)便快捷，且特異度更高的新型分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)[5-7]。LAMP技術(shù)采用Bst-DNA聚合酶，針對(duì)模板DNA的6個(gè)靶區(qū)巧妙設(shè)計(jì)1對(duì)內(nèi)部復(fù)合引物和1對(duì)外圍引物，通過(guò)60 ℃恒溫水浴30～60 min，可獲得超過(guò)10億拷貝的擴(kuò)增產(chǎn)物[8-10]。本課題組設(shè)計(jì)了一套新的針對(duì)NG菌株porA基因保守序列的LAMP檢測(cè)系統(tǒng)，并分析其與國(guó)內(nèi)主流淋球菌PCR檢測(cè)技術(shù)的差異。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1月至2019年1月本院32例淋病性宮頸炎和88例非淋病性宮頸炎患者的宮頸膿性分泌物拭子。排除院前使用抗菌藥物治療病例,所有患者獲得NG細(xì)菌培養(yǎng)證據(jù)。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2LAMP反應(yīng)體系設(shè)計(jì) 從Genebank獲取NG porA基因堿基序列。在線設(shè)計(jì)1對(duì)內(nèi)部復(fù)合引物FIP、BIP(FIP是F2與F1c的復(fù)合引物，BIP是B2與B1c復(fù)合引物)和1對(duì)外圍引物F3、B3(https://primerexplorer.jp/)。DNA模板2.0 μL，Bst DNA聚合酶1.0 μL，引物Mix 2.5 μL，反應(yīng)Mix 12.0 μL，雙蒸水2.5 μL，反應(yīng)體系20.0 μL，保持60 ℃水浴50 min，85 ℃維持2 min。每管加入1.0 μL 顯色劑SYTO-9，綠色判為陽(yáng)性。

1.3儀器與試劑 LAMP反應(yīng)引物由生工生物(上海)股份有限公司合成，采用凱杰公司試劑提取上述標(biāo)本DNA后，使用60 ℃水浴箱進(jìn)行LAMP檢測(cè)。PCR儀器為美國(guó)ABI7500 PCR儀。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將120例LAMP數(shù)據(jù)與120例PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)設(shè)計(jì)，比較兩種方法陽(yáng)性檢出率差異，采用McNemar檢驗(yàn)計(jì)算確切概率。將32例淋病數(shù)據(jù)和88例非淋病性宮頸炎患者數(shù)據(jù)分層。淋病組數(shù)據(jù)配對(duì)后，比較靈敏度差異；非淋病組數(shù)據(jù)配對(duì)后，比較特異度差異，采用Fisher確切概率法。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1引物及相關(guān)參數(shù) 各引物5′端自由能(5′dG)和3′端自由能(3′dG)均小于-4.00，Tm均為60 ℃左右。見(jiàn)表1。

表1 LAMP系列引物的相關(guān)參數(shù)

注：-表示此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

2.2LAMP技術(shù)和PCR技術(shù)檢測(cè)性能分析 120例淋病性和非淋病性宮頸炎標(biāo)本的LAMP和PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果配對(duì)數(shù)據(jù)，通過(guò)McNemar確切概率檢驗(yàn)，兩種方法陽(yáng)性檢出率分別為25.83%、20.83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LAMP和PCR的靈敏度分別為96.88%、78.13%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；二者特異度均為100.00%。見(jiàn)表2。

表2 LAMP技術(shù)和PCR技術(shù)檢測(cè)性能分析

3 討 論

NG具有較強(qiáng)的抗菌藥物耐藥潛力[11-13]。20世紀(jì)80年代，中國(guó)淋球菌耐藥監(jiān)測(cè)系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生[2-3]。從理論上分析，男性與女性患病率應(yīng)接近1∶1。然而，近30余年來(lái)，女性淋病患者的陽(yáng)性檢出率一直遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于男性[3]。造成女性患者大量漏診的因素較復(fù)雜，涉及以下6個(gè)方面：(1)女性患者常常是隱性感染，檢出率低；(2)女性生殖道微生態(tài)復(fù)雜度高，降低了PCR靈敏度；(3)錯(cuò)誤將陰道后穹窿分泌物等同于宮頸分泌物送檢進(jìn)行NG PCR檢測(cè)；(4)抗菌藥物導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)假陰性；(5)多數(shù)基層實(shí)驗(yàn)室無(wú)二氧化碳培養(yǎng)箱等硬件設(shè)備；(6)檢驗(yàn)技師未掌握NG培養(yǎng)方法。

因此，亟需建立一種廉價(jià)、技術(shù)門(mén)檻低、靈敏度和特異度高的檢測(cè)方法，以有效降低女性淋病患者漏診率。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，LAMP技術(shù)是一種極其適用于NG檢測(cè)的分子生物學(xué)新技術(shù)，具有3點(diǎn)明顯優(yōu)勢(shì)[14]：(1)檢測(cè)溫度恒定在60 ℃左右，基因擴(kuò)增結(jié)果可視化。不需要昂貴PCR儀器，試劑不涉及熒光探針，成本低。這適合大多數(shù)醫(yī)院常規(guī)開(kāi)展淋病篩查。(2)LAMP技術(shù)繞開(kāi)了主流實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)包含的溫度梯度循環(huán)程序，避免了溫度梯度循環(huán)的時(shí)間損耗，直接降低檢測(cè)時(shí)間至1 h之內(nèi)。(3)檢測(cè)系統(tǒng)需要兩套引物，檢測(cè)的特異度較PCR高。但是LAMP技術(shù)較傳統(tǒng)PCR技術(shù)更復(fù)雜，引物設(shè)計(jì)較難，這是限制其應(yīng)用的主要因素之一。

本項(xiàng)研究的新穎之處在于，本課題組自主設(shè)計(jì)了一套新的針對(duì)NG細(xì)菌porA基因保守序列的LAMP檢測(cè)系統(tǒng)。LAMP技術(shù)的核心在于設(shè)計(jì)前向內(nèi)引物和后向內(nèi)引物的篩選，以及5′dG和3′dG小于-4.00，并避免引物間的二聚體。本套引物自由能最大值為-4.62，最小值為-6.42，利于引物5′端的特異性結(jié)合，利于3′端正確引發(fā)。本研究運(yùn)用Oligo6.0分析并修正了個(gè)別堿基，控制了4個(gè)引物間二聚體的發(fā)生率。通過(guò)上述工作，從理論上保證了引物特異性。

為進(jìn)一步驗(yàn)證本課題組設(shè)計(jì)的LAMP方法的檢出率，收集了NG細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性的32例淋病性宮頸炎和88例非淋病性宮頸炎患者的宮頸膿性分泌物拭子，同時(shí)進(jìn)行LAMP檢測(cè)和PCR檢測(cè)，以比較兩種檢測(cè)技術(shù)的差異。NG PCR檢測(cè)及細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，價(jià)格高，不適合門(mén)診患者及時(shí)診治，患者接受程度低。傳統(tǒng)PCR技術(shù)在擴(kuò)增效率為100%的前提下，擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)2n倍增長(zhǎng)，27個(gè)循環(huán)后，可以達(dá)到1億個(gè)拷貝數(shù)。然而，LAMP檢測(cè)技術(shù)的循環(huán)擴(kuò)增階段比PCR循環(huán)復(fù)雜，產(chǎn)物遠(yuǎn)超2n倍增長(zhǎng)[15]。故LAMP技術(shù)在方法學(xué)上擁有更高的靈敏度。本研究經(jīng)檢測(cè)120例細(xì)菌性宮頸炎患者宮頸分泌物標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)靈敏度比NG PCR技術(shù)高，為96.88%，檢測(cè)時(shí)間由2 h縮短至50 min以內(nèi)。本課題所設(shè)計(jì)的NG LAMP系統(tǒng)只需要60 ℃水浴30～50 min就可以依據(jù)顯色劑SYTO-9的顏色變化判斷陰陽(yáng)性，是一種較理想的淋病分子生物學(xué)篩查技術(shù)。本課題的不足之處在于驗(yàn)證的樣本量尚不夠多，應(yīng)在更大的人群中進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的檢測(cè)效能。

總之，正確推廣LAMP技術(shù)可大幅提升女性淋病患者的陽(yáng)性檢出率，降低漏診率。