碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌臨床分布及耐藥基因檢測

蔡心安，蔡龍嘯，閆 敏,姚慧琳

1.中國人民解放軍聯勤保障部隊901醫院檢驗科，安徽合肥 230031；2.安徽醫科大學第一臨床醫學院，安徽合肥 230022;3.安徽省淮北礦工總醫院檢驗科，安徽淮北 235000

碳青霉烯類抗菌藥物是一類抗菌譜廣泛的抗菌藥物，對各類β-內酰胺酶十分穩定，因此成為治療腸桿菌科細菌所致感染的首選藥物[1]，但隨著臨床的廣泛使用，對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的腸桿菌出現，給臨床治療帶來極大困難。碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)的主要耐藥機制是產碳青霉烯酶和高產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)、頭孢菌素酶(AmpC酶)或者合并膜孔蛋白缺失[2]。不同地區或不同醫院的細菌耐藥機制會有所差異，為了解中國人民解放軍聯勤保障部隊901醫院CRKP的臨床分布及耐藥機制，本研究采用PCR法對2017年1月1日至2017年12月31日在中國人民解放軍聯勤保障部隊901醫院(以下簡稱本院)住院患者感染的CRKP進行碳青霉烯酶基因及其他β-內酰胺酶基因進行研究，為臨床治療感染及預防院內感染提供幫助，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源 收集2017年1月1日至2017年12月31日在本院住院患者的各類臨床標本中分離出的非重復CRKP 23株。其中包括痰標本16例，分泌物標本3例，導管標本2例，血液標本1例，尿液標本1例。

1.1.2試劑與儀器 由BD公司PHNX10進行鑒定及藥敏試驗，抗菌藥物氨芐西林、左氧氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、頭孢他啶、亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢唑啉標準品均購自中國藥品生物制品鑒定所。藥敏紙片亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢唑啉、氨曲南、頭孢他啶、頭孢吡肟均購自英國Oxoid公司。水解酪蛋白瓊脂為天達診斷試劑公司產品，PCR擴增試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒等為北京天根公司產品。

1.2方法

1.2.1可疑產碳青霉烯酶菌株篩選 儀器法報告的亞胺培南或美羅培南耐藥肺炎克雷伯菌均作為可疑株，用K-B法對這些可疑株進行復檢，以兩種方法均報耐藥的肺炎克雷伯菌作為試驗對象。判斷標準按照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI) 2017年標準執行，質控菌株大腸埃希菌ATCC25922。

1.2.2最低抑菌濃度(MIC)測定 采用瓊脂稀釋法，對倍連續稀釋亞胺培南、美羅培南、氨芐西林、左氧氟沙星、阿米卡星、頭孢他啶、頭孢吡肟等7種抗菌藥物，測定可疑產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的7種藥物MIC值。

1.2.3改良Hodge試驗 用無菌生理鹽水制備0.5號麥氏單位的大腸埃希菌ATCC25922懸液作為指示菌，10倍稀釋后按常規紙片法藥敏試驗操作MHA平板，自然干燥10 min，在平板中心貼厄他培南紙片(10 μg/片)。挑取3～5個血平板上過夜培養的待測菌和質控菌株的菌落，從紙片邊緣向外劃一條至少25 mm的直線，孵育后觀察結果，待測菌株與抑菌環交叉處出現矢狀生長的為產碳青霉烯酶陽性株[3]。

1.2.4碳青霉烯酶基因及其他β-內酰胺酶基因引物設計 參照文獻[4]設計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，碳青霉烯酶基因及其他β-內酰胺酶基因引物序列見表1。

表1 β-內酰胺酶基因引物

1.2.5碳青霉烯酶基因及其他β-內酰胺酶基因的PCR擴增與測序 改良Hodge試驗陽性菌株，采用煮沸法提取細菌基因組DNA。PCR反應總體積為50 μL，包括上、下游引物各1 μL，PCR Magic Mix 25 μL,DNA模板5 μL(5 ng)，用雙蒸水(ddH2O)補充至50 μL。循環參數：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 40，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外凝膠電泳成像儀下觀察并拍照。PCR陽性產物送上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序，測序結果進行BLAST比對分析。

2 結 果

2.123株CRKP臨床分布情況 CRKP分布廣泛，23株CRKP檢出的臨床科室為神經外科(12株，占52.17%)、重癥監護病房(ICU,3株，占13.04%)、普外科(2株，占8.70%)、干部病房(2株，占8.70%)、泌尿外科(1株，占4.35%)、骨科(1株，占4.35%)、五官科(1株，占4.35%)、眼科(1株，占4.35%)。神經外科與ICU共占65.21%，重癥患者CRKP檢出較高。

2.2CRKP臨床標本分布情況 23株CRKP中，16株(69.57%)為痰標本，5株(21.74%)來源于分泌物或膿液，1株(4.35%)為血液標本，1株(4.35%)為中段尿標本。其中痰標本占近70%，而從無菌體液中檢出CRKP具有重要意義。

2.323株CRKP的最低抑菌濃度(MIC) 氨芐西林MIC為64～4 096 μg/mL，阿米卡星MIC為1～2 048 μg/mL，亞胺培南MIC為1～1 024 μg/mL，美羅培南MIC為1～1 024 μg/mL，頭孢他啶MIC為64～2 048 μg/mL，頭孢吡肟MIC為64～2 048 μg/mL，左氧氟沙星MIC為0.5～512.0 μg/mL。臨床檢出23株CRKP對臨床常用抗菌藥物的MIC。

2.4改良Hodge試驗結果 23株CRKP改良Hodge試驗結果均為陽性。

2.5臨床分離CRKP碳青霉烯酶基因檢測結果 23株CRKP中21株攜帶blaKPC-2基因，其電泳圖見圖1。PCR擴增產物經測序、BLAST比對分析，證實為blaKPC-2基因。

注：M為DNA Marker,自下而上2 000、1 000、750、500、250、100 bp；N為陰性對照；1～6泳道為試驗菌株。

圖1 blaKPC-2基因電泳圖

2.6其他β-內酰胺酶基因檢測結果 對21株產KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，同時檢測其他β-內酰胺酶基因，結果顯示19株攜帶blaKPC-2基因同時攜帶blashv-1基因，2株攜帶blaKPC-2基因同時攜帶blashv-1、blactx-m-15基因。blashv-1、blactx-m-15基因電泳圖見圖2、3。

注：M為DNA Marker，自下而上2 000、1 000、750、500、250、100 bp；P為陽性對照，N為陰性對照；泳道1～3為試驗菌株。

圖2 blashv-1基因電泳圖

注：M為DNA Marker,自下而上2 000、1 000、750、500、250、100 bp；N為陰性對照；泳道1～3為blaKPC-2試驗菌株，泳道4～5為blactx-m-15試驗菌株。

圖3 blactx-m-15基因電泳圖

3 討 論

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用、侵襲性操作應用等原因，細菌性耐藥問題成為全球醫學界共同關注的焦點[5]。近幾年，長期大量、不規范合理使用碳青霉烯類抗菌藥物導致對其耐藥的腸桿菌呈逐年發展的趨勢[6]。在社區及醫院內感染中，腸桿菌科細菌是重要的病原菌，臨床上多重耐藥菌的出現也使其耐藥問題日益嚴峻[7]。肺炎克雷伯菌檢出率在各家醫院均處于前5位，是造成醫院內感染的重點細菌，其耐藥率呈逐年上升的趨勢。據全國細菌耐藥監測網(CHINET)監測報告，2015-2016年我國肺炎克雷伯對碳青霉烯類的耐藥率為14.4%～15.8%[8]，各地區稍有不同，可能與用藥方式和習慣有關。本院2017年CRKP檢出率為8.2%，根據CHINET監測數據顯示，2017年CRKP的檢出率平均為9.0%，安徽省細菌耐藥監測網顯示，安徽省CRKP的檢出率平均為17.8%?？梢姳驹悍窝卓死撞哪退幥闆r低于全省，這可能與本院用藥情況、用藥習慣等有關，今后繼續加強用藥管理，延緩耐藥菌產生。

產生碳青霉烯水解酶是腸桿科細菌碳青霉烯耐藥的主要機制[9]。本研究發現，本院23株CRKP均產ESBLs，耐藥基因檢出情況為19株同時攜帶blaKPC-2、blashv-1，2株同時攜帶blaKPC-2、blashv-1、blactx-m-15，與宮雪等[2]報道相似。提示本院CRKP的主要耐藥機制可能是KPC-2型碳青霉烯酶同時聯產SHV-1型酶。另2株未檢出KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，其耐藥機制后續將繼續研究。

本研究中CRKP分布廣泛，在臨床能引起多個部位感染，主要分離自痰標本，占各類標本的69.57%，這些細菌來自不同科室，而臨床主要來源于神經外科和ICU這些重癥患者，占總分離率的65.21%，與國內報道一致[10]。經國內一些專家研究證實，CRKP可以在重癥病房與普通病房間傳播，是導致肺炎克雷伯菌耐藥性不斷上升及CRKP檢出率逐年提高的主要原因。

綜上所述，為預防CRKP檢出率上升，有效控制醫院內感染的發生，應積極配合醫院感染部門，并與臨床進行溝通，做好CRKP的監測與防控工作，以降低產生CRKP風險，為臨床治療肺炎克雷伯菌導致的感染提供幫助。