NOTUM基因在骨肉瘤中的表達及臨床意義

解克非，金 鐸，李大鵬，黃海生

遼寧電力中心醫(yī)院骨科，遼寧沈陽 110004

骨肉瘤多發(fā)于兒童和青少年，是常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，易發(fā)生轉(zhuǎn)移。骨肉瘤常見于股骨遠端(43%)、脛骨近端(23%)或肱骨(10%)，患者會產(chǎn)生劇烈疼痛或病理性骨折等現(xiàn)象，15%～20%的患者伴有病灶轉(zhuǎn)移[1]。近年來，隨著新型輔助化療的應(yīng)用，骨肉瘤5年生存率從20%提高至目前的50%～70%，但仍有部分患者會面臨截肢或死亡危險[2]。因此，探討骨肉瘤發(fā)病機制，尋找影響骨肉瘤發(fā)展、預(yù)后等關(guān)鍵基因，有可能為骨肉瘤的治療帶來新思路。NOTUM基因最初在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，參與脊椎動物胚胎時期動物神經(jīng)和頭部生長[3]。NOTUM基因在人體內(nèi)作為磷脂酰聚糖磷脂酶存在，能夠抑制Wnt信號通路，從而影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理學(xué)活動[4]。有報道指出，NOTUM基因在多種腫瘤中呈高表達。胡翀等[5]研究顯示，NOTUM基因在胃癌組織中呈高表達，陽性表達患者的生存時間明顯低于陰性表達者，可能成為胃癌預(yù)后的潛在標(biāo)志物。目前鮮見關(guān)于NOTUM基因在骨肉瘤中的作用的報道，因此，本研究將探討NOTUM基因在骨肉瘤中的表達及臨床意義，以期為骨肉瘤的治療提供幫助。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年3月至2014年4月來本院就診的68例骨肉瘤患者，取其癌組織作為試驗組，取其正常骨骼肌組織作為對照組。68例骨肉瘤患者中男43例，女25例；年齡8～47歲，平均(21.54±8.32)歲。按腫瘤部位分為脛骨/股骨55例，其他部位13例；按Enneking分期[6]分為Ⅰ～ⅡA期 27例，ⅡB～Ⅲ期41例；按有無遠處轉(zhuǎn)移分為有遠處轉(zhuǎn)移24例，無遠處轉(zhuǎn)移44例；按病理類型分為骨母細(xì)胞型27例，軟骨母細(xì)胞型12例，纖維母細(xì)胞型22例，其他類型7例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理切片確診為骨肉瘤者；(2)術(shù)前未進行放、化療及藥物治療者；(3)臨床資料、隨訪資料完整者；(4)患者及其家屬知情同意，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)合并心臟、肝、腎等疾病者；(3)自身免疫性疾病者。對骨肉瘤患者進行隨訪，為期5年，從術(shù)后第1天起，定期記錄患者的生存狀況，隨訪日期截至2019年5月1日，存活45例，死亡23例，無失訪病例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 TRIzol Reagent(貨號：15596018)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，One Step RT-PCR Kit(貨號：210212)購自德國Qiagen公司，Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(貨號：K1622)購自北京百諾威生物科技有限公司，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(T100型)購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，兔抗人NOTUM多克隆抗體(貨號：NBP2-33670)購自美國Novus Biologicals公司，免疫組化試劑盒(通用型，貨號：AAPR389-A100)購自廣州沛瑜生物制品有限公司。

1.3方法

1.3.1樣本采集 取骨肉瘤患者術(shù)中癌組織作為試驗組，取其正常骨骼肌組織作為對照組。將所有的組織樣本分為2份，一份用于制作石蠟切片；另一份用于RNA抽提，存于-80 ℃冰箱。

1.3.2qRT-PCR測定骨肉瘤組織中NOTUM mRNA的表達 于-80 ℃冰箱取出組織樣本，將樣本剪碎裝入試管中，加入1 mL TRIzol破碎勻漿，按照TRIzol RNA提取說明書提取組織中總RNA，將所得RNA溶于RNase Free H2O，檢測其純度及濃度。按照Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應(yīng)體系20 μL： 2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，H2O 6 μL。每個樣品做3個復(fù)孔。根據(jù)目的基因設(shè)計對應(yīng)的引物，以β-actin為內(nèi)參，引物序列見表1。反應(yīng)條件：94 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。根據(jù)各樣本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計算 NOTUM mRNA相對表達量。

表1 NOTUM及內(nèi)參基因β-actin引物序列

1.3.3免疫組化檢測骨肉瘤組織中NOTUM蛋白的表達情況 石蠟切片脫蠟水化：將切片置于檸檬酸緩沖液中，96 ℃加熱10 min，加3% H2O2常溫孵育15 min，加EDTA修復(fù)液，抗原熱修復(fù)完成，自然冷卻后采用PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，滴加一抗工作液于濕盒中孵育過夜，PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，加入二抗孵育30 min，PBS沖洗5 min，重復(fù)3次，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，顯色成功后，蒸餾水沖洗，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明處理后，封片鏡檢。結(jié)果判定：細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中存在棕色或棕黃色顆粒即為陽性細(xì)胞，在鏡下觀察切片，隨機選取5個視野計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，1分為陽性細(xì)胞數(shù)<10%，2分為10%～<50%，3分為50%～<80%，4分為≥80%。根據(jù)染色強度：1分為輕度染色，2分為中度染色，3分為強染色。每例樣本的總分=陽性細(xì)胞率×染色強度，總分1～3分記為陰性，4～12分記為陽性。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR測定組織中NOTUM mRNA表達量 試驗組NOTUM mRNA的相對表達量(2.62±0.95)明顯高于對照組(0.76±0.28)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.487，P<0.001)。

2.2兩組NOTUM蛋白表達情況 試驗組NOTUM蛋白的陽性表達率為61.76%(42/68)，明顯高于對照組的8.82%(6/68)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.441，P<0.001)。

表2 骨肉瘤患者癌組織中NOTUM表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3骨肉瘤患者癌組織中NOTUM表達與臨床病理特征的關(guān)系 骨肉瘤患者癌組織中NOTUM蛋白陽性率與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑和病理類型無關(guān)(P>0.05)，與Enneking分期和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表2。

2.4骨肉瘤癌組織中NOTUM表達與患者預(yù)后的關(guān)系 對骨肉瘤患者隨訪60個月，生存45例，死亡23例。繪制骨肉瘤患者術(shù)后1～60個月NOTUM陽性、陰性患者的生存曲線。NOTUM陽性患者及陰性患者5年的總生存率分別為57.14%(24/42)、80.77%(21/26)，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 骨肉瘤癌組織中NOTUM表達陰性、陽性患者5年生存曲線

2.5影響骨肉瘤患者預(yù)后的因素分析 單因素分析顯示，NOTUM表達、Enneking分期和遠處轉(zhuǎn)移均是影響骨肉瘤患者預(yù)后的危險因素。多因素分析顯示，NOTUM表達和遠處轉(zhuǎn)移均是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨立危險因素。見表3。

表3 影響骨肉瘤患者預(yù)后的因素分析

注：HR為風(fēng)險比。

3 討 論

骨肉瘤是最常見的骨癌，在兒童和青年中發(fā)病率較高，惡性程度高，復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高，其特征是腫瘤細(xì)胞直接形成未成熟骨或類骨質(zhì)組織[7]。常見臨床癥狀包括骨骼疼痛及腫脹，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展受多因子、多基因調(diào)控，染色體異常、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控異常和抑癌基因失活等都可能誘發(fā)骨肉瘤[8]。骨肉瘤的新輔助化療已取得長足進步，但仍有不少患者會出現(xiàn)化療耐藥性或肺轉(zhuǎn)移，造成患者死亡[9]。骨肉瘤的發(fā)病機制還未完全明確，目前仍缺乏有效的臨床預(yù)后指標(biāo)。

人NOTUM基因最早的名稱為LOC147111，是一種α水解酶，位于人染色體17q25.3處，含有11個外顯子[10]。NOTUM基因表達可影響Wnt信號通路的傳導(dǎo)，從而在腫瘤和其他疾病中發(fā)揮作用。Wnt信號通路在指導(dǎo)胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞生理活動中至關(guān)重要，在調(diào)節(jié)成年組織穩(wěn)態(tài)中同樣起重要作用，且Wnt信號的異常激活能夠啟動編碼癌蛋白和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子基因，從而影響細(xì)胞增殖[11]。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的異常激活與許多癌癥有關(guān)，Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性下降，可導(dǎo)致傷口愈合和結(jié)構(gòu)形成不良[12]。已有研究證明，Wnt信號傳導(dǎo)異常涉及多種不同類型的癌癥。研究表明，NOTUM基因具有一個特殊的結(jié)構(gòu)，狀似一個疏水口袋，能夠容納不飽和脂肪酸及其酶活性的性質(zhì)，此特點可保證NOTUM基因優(yōu)先作用于Wnt蛋白，從而影響Wnt信號通路[13]。TORISU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，NOTUM基因在肝癌中呈高表達，其高表達與細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白的積累顯著相關(guān)，證明NOTUM基因在Wnt/β-catenin信號激活的肝癌組織中表達上調(diào)。DE ROBERTIS等[15]研究表明，NOTUM基因在小鼠結(jié)直腸癌組織中呈高表達，其表達與β-catenin蛋白表達呈正相關(guān)，但其具體作用部位還未明確。

本研究檢測NOTUM基因在骨肉瘤組織中的表達，結(jié)果顯示，試驗組NOTUM mRNA和蛋白表達均明顯高于對照組，提示高NOTUM基因和蛋白表達可能在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用；骨肉瘤患者癌組織中NOTUM蛋白陽性率與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑和病理類型無關(guān)，與Enneking分期和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示NOTUM表達可能會影響骨肉瘤患者部分病程進展；繪制骨肉瘤患者術(shù)后1～60個月生存曲線，結(jié)果表明，NOTUM蛋白陰性患者5年生存率明顯高于陽性患者，提示NOTUM陽性表達對骨肉瘤患者起預(yù)后不良效果；Cox回歸分析顯示，NOTUM表達、Enneking分期和遠處轉(zhuǎn)移均是影響骨肉瘤患者預(yù)后的危險因素，其中NOTUM表達和遠處轉(zhuǎn)移均是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨立危險因素，提示抑制NOTUM表達可能會改善骨肉瘤患者的預(yù)后狀況。

綜上所述，骨肉瘤患者癌組織中NOTUM呈高表達，其表達與Enneking分期和遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨立危險因素，與患者預(yù)后密切相關(guān)，有望成為骨肉瘤的潛在治療靶點。但本研究納入樣本量較少，可能存在一定的局限性，日后將不斷擴大樣本量，繼續(xù)深入研究，進一步明確NOTUM基因成為骨肉瘤治療靶點的可行性。