黑木耳多糖對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝的影響

張 赫,楊 檸,李家富,吳 迪,佟 月,沈 楠,張美超

(吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.臨床醫(yī)學(xué)院，2.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,吉林 吉林 132013)

非酒精性脂肪性肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是由除乙醇等其他明確損傷肝因素引起的，以肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性為主的臨床病理綜合征。其病變過(guò)程是由非酒精性單純性脂肪肝依次進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化，最終進(jìn)展成肝細(xì)胞癌而死亡[1]。黑木耳多糖有D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖及葡萄糖醛酸等多種重要成分，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗血栓、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、降低動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖等多種藥理活性[2]。因此，本研究探討黑木耳多糖對(duì)NAFLD大鼠脂代謝的影響，為黑木耳多糖調(diào)節(jié)脂代謝、改善肝脂肪變提供理論參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黑木耳多糖(西安天瑞生物);洛伐他汀(鄭州創(chuàng)美生物科技有限公司)；脫氧膽酸鈉(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；膽固醇(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；1,2-丙二醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；玉米油(長(zhǎng)春市富民達(dá)榨油機(jī)械有限公司)；奶粉(大慶乳品廠有限責(zé)任公司)；蔗糖(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)；總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 主要儀器

PT-3502B酶標(biāo)分析儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司);電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)貝克曼公司)，普通高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf);722分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);PT-3502B酶標(biāo)分析儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司);電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);普通高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf);數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市江南儀器廠)。

1.3 高脂乳劑的配制

依據(jù)參考文獻(xiàn)加以調(diào)整[3]，分為水相和油相。水相：向燒杯里依次加入蒸餾水、蔗糖、脫氧膽酸鈉及奶粉并攪拌均勻；油相：將先將1,2-丙二醇和玉米油倒入燒杯，將燒杯放入80 ℃恒溫水浴箱內(nèi)，再慢慢加入膽固醇，并用玻璃棒不停攪拌。最后將水相倒入油相，充分?jǐn)嚢瑁纯傻玫街救槟z。

1.4 動(dòng)物分組及模型建立

Wistar雄性大鼠，體重為200～250 g(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取60只健康雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組,模型對(duì)照組,黑木耳多糖低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg)及洛伐他汀組(7.48 mg/kg)。除空白對(duì)照組外，其他組每日灌胃1次高脂乳劑(1 mL/100 g)。10 h后，給藥組按1 mL/100 g分別灌胃相應(yīng)藥物，空白對(duì)照組及模型對(duì)照組灌胃同等體積的生理鹽水，連續(xù)進(jìn)行6周實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食不禁水8 h，稱重大鼠，采用10%的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血。一部分全血裝入真空采血管，送檢驗(yàn)科測(cè)載脂蛋白；另一部分裝于離心管中，以2500 r/min離心15 min，分離獲取適量血清，嚴(yán)格按照試劑盒規(guī)定檢測(cè)并記錄TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量。

1.6 肝臟HE標(biāo)本制備

分別取各組大鼠肝左葉相同部位、大小的肝組織，使用冰生理鹽水洗凈肝表面血跡，中性甲醛固定肝組織，石蠟包埋，常規(guī)切片及HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝組織的病變情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 黑木耳多糖對(duì)大鼠肝濕重、肝指數(shù)的影響

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠肝濕重、肝指數(shù)均升高，其中肝濕重具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組相比，洛伐他汀組大鼠肝濕重、肝指數(shù)均下降(P<0.01)；黑木耳多糖低、中、高劑量組大鼠肝濕重、肝指數(shù)均降低，其中，黑木耳多糖低、高劑量組肝濕重具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，黑木耳多糖中、高劑量組肝指數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且肝指數(shù)呈劑量依賴性下降，如表1所示。

表 1 黑木耳多糖對(duì)大鼠肝濕重、肝指數(shù)的比較

與對(duì)照組比較，aP<0.01;與模型組比較，bP<0.01

2.2 大鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化

如圖1所示，空白對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常；模型對(duì)照組肝小葉不完整，肝細(xì)胞可見明顯的脂肪變，甚至見肝細(xì)胞壞死；洛伐他汀組肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，偶見肝細(xì)胞脂肪變；黑木耳多糖低、中、高劑量組肝小葉較為完整，偶見肝細(xì)胞脂肪變，組間變化不明顯。

2.3 黑木耳多糖對(duì)載脂蛋白的影響

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組apoA1水平降低(P<0.01)，apoB水平升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，洛伐他汀組apoA1、apoB水平均降低(P<0.01)；黑木耳多糖中劑量組apoA1水平降低(P<0.01)，黑木耳多糖低、中、高劑量組apoB水平均降低，如表2所示。

A:空白對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：洛伐他汀組；D：黑木耳多糖低劑量組；E：黑木耳多糖中劑量組；F：黑木耳多糖高劑量組

圖 1 黑木耳多糖對(duì)大鼠肝臟的影響

表 2 黑木耳多糖對(duì)大鼠載脂蛋白的影響

與對(duì)照組比較，aP<0.01;與模型組比較，bP<0.01

2.4 黑木耳多糖對(duì)大鼠血脂的影響

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組血清TG、TC含量均升高(P<0.01)，LDL-C含量亦升高，HDL-C含量下降。與模型對(duì)照組對(duì)比，洛伐他汀組TG、TC含量均下降(P<0.05)，LDL-C、HDL-C含量均升高；黑木耳多糖低、中、高劑量組TG、TC含量均下降(P<0.01)，LDL-C水平下降，HDL-C組呈波動(dòng)性改變，如表3所示。

3 討 論

以往認(rèn)為，肥胖是NAFLD病最常見的危險(xiǎn)因素之一，且與脂肪肝形成最為密切。新近研究表明,并非肥胖程度越高越易誘發(fā)脂肪肝，體重指數(shù)正常的人群也可發(fā)生脂肪肝。與皮下脂肪性肥胖相比，內(nèi)臟脂肪性肥胖與脂肪肝的形成密切相關(guān)。而肝指數(shù)是反映內(nèi)臟脂肪性肥胖與脂肪肝關(guān)系的主要檢測(cè)指標(biāo)，與內(nèi)臟脂肪性肥胖呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：模型對(duì)照組大鼠肝指數(shù)較正常組明顯升高，提示肝指數(shù)一定程度反映了肝脂肪變。洛伐他汀治療有效。黑木耳多糖低、中、高劑量藥物干預(yù)后，大鼠肝指數(shù)較模型組明顯下降，且具有劑量依賴性，尤其中、高劑量組恢復(fù)肝指數(shù)程度相對(duì)明顯。大鼠肝臟組織HE染色結(jié)果與此相似，黑木耳多糖低、中、高劑量組均具有明顯的降低肝細(xì)胞脂肪變性程度的作用。結(jié)果表明黑木耳多糖具有改善肝細(xì)胞脂肪變性的藥理作用。

表 3 黑木耳多糖對(duì)大鼠血脂的影響

與對(duì)照組比較，aP<0.01;與模型組比較，bP<0.01

肝脂肪變是多種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量增多，特別是TG的堆積[4]。TC、TG、LDL-C的升高會(huì)促進(jìn)脂肪肝的發(fā)展，HDL-C則會(huì)把動(dòng)脈壁上及周圍組織的膽固醇帶到肝內(nèi)代謝，阻止脂質(zhì)在動(dòng)脈壁和肝內(nèi)積累，抑制脂肪肝的形成[5]。因此，脂代謝與TC、TG、LDL-C、HDL-C含量密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀可使TG、TC水平下降，LDL-C、HDL-C水平升高；而黑木耳多糖低、中、高劑量組具有明顯的降TG、TC水平，但降LDL-C作用不明顯，而HDL-C呈波動(dòng)性改變。這說(shuō)明，黑木耳多糖的確可起到降血脂的目的，但其作用機(jī)制可能與洛伐他汀不同。

甘油三酯和膽固醇等的合成與分解主要在肝細(xì)胞中，線粒體為脂肪酸分解代謝β-氧化的主要場(chǎng)所，機(jī)體主要通過(guò)LDL-C受體途徑和單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除LDL-C等產(chǎn)物。但是，迄今為止，脂代謝異常的機(jī)制不明確。載脂蛋白在脂代謝過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。apoA1是肝臟產(chǎn)生HDL-C所需的載脂蛋白[6]，逆轉(zhuǎn)TC至肝臟也是經(jīng)過(guò)apoA1實(shí)現(xiàn)的。apoB是肝臟產(chǎn)生LDL-C過(guò)程中所用的主要載脂蛋白，促進(jìn)LDL-C將TC運(yùn)送至外周血液。細(xì)胞膜上的LDL-C受體也可以經(jīng)過(guò)apoB識(shí)別LDL-C并將LDL-C轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，所以apoB可以間接反映LDL-C水平[7]。本次研究發(fā)現(xiàn)：陽(yáng)性藥可降低apoA1、apoB的水平，而黑木耳多糖只有中劑量組表現(xiàn)出明顯地抑制apoA1、apoB的水平[8]。以上說(shuō)明，黑木耳多糖有部分通過(guò)載脂蛋白調(diào)控血脂代謝的作用。

總之，黑木耳多糖能改善脂肪變實(shí)驗(yàn)大鼠的一般狀態(tài)，減輕肝內(nèi)脂質(zhì)沉積，改善肝脂肪變性程度，具有保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)血脂的作用，為NAFLD的干預(yù)及治療提供新的理論依據(jù)。然而，黑木耳多糖對(duì)NAFLD大鼠血脂起效途徑的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。