熒光定量PCR在念珠菌性陰道炎診斷中的應(yīng)用價(jià)值

羅翔宇

(禹州市婦幼保健院 檢驗(yàn)科，河南 許昌 461670)

陰道炎是女性高發(fā)的一種婦科病，患者多因細(xì)菌性感染發(fā)病，多種細(xì)菌均可誘發(fā)陰道感染，因此臨床治療女性細(xì)菌性陰道炎前需鑒別出感染細(xì)菌種類[1]。臨床發(fā)現(xiàn)念珠菌是細(xì)菌性陰道炎的主要致病菌之一，且復(fù)發(fā)率較高，對患者生活影響較大。細(xì)菌培養(yǎng)法是常規(guī)診斷細(xì)菌性陰道炎的方法，耗時較長，不利于及時治療。熒光定量PCR是新型PCR檢測技術(shù)，快速高效[2]。本研究旨在探討熒光定量PCR在念珠菌性陰道炎診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年8月至2019年8月禹州市婦幼保健院接收的62例疑似陰道炎患者，年齡29～57歲，平均(42.86±7.26)歲，病程3～8個月，平均(5.83±1.24)個月。所有患者均接受陰道分泌物核酸雜交法檢測，結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。排除真菌感染患者?；颊咦栽竻⑴c本研究并簽署知情同意書。本研究經(jīng)禹州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 檢測方法

1.2.1熒光定量PCR 使用無菌性棉簽蘸取患者陰道分泌物，使用美國Bio-Rad伯樂實(shí)時熒光定量PCR儀(規(guī)格：CFX384 Touch)及其配套的試劑盒、器皿，將患者陰道分泌物和生理鹽水混合成1 000 μL，1 500 r·min-1離心15 min，靜置10 min后去除上層清液，加入組織裂解液，60 ℃水育15 min，再次1 500 r·min-1離心15 min，取上層清液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×蒸餾水55 μL、10×反應(yīng)緩沖液(北京博爾邁生物科技有限公司)10 μL、4×dNTPs(各1.25 mmol·L-1，由賽默飛世爾科技有限公司提供)16 μL，上海博雅生物技術(shù)有限公司提供的DNA模板10 μL，Taq聚合酶0.5 μL。將反應(yīng)體系配置好后置于實(shí)時熒光定量PCR儀上，設(shè)置參數(shù)：以94 ℃ 60 s；37 ℃ 60 s，72 ℃ 120 s順序依次進(jìn)行，循環(huán)30次后使用瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，與陽性對照樣本和陰性對照樣本對比。陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)：條帶寬度≤1 mm，并在預(yù)期堿基范圍內(nèi)，背景無藥斑或引物二聚體。在預(yù)期堿基范圍之外為假陽性。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)法 將采集的患者陰道分泌物置于干凈的細(xì)菌培養(yǎng)皿中，加入適量的細(xì)菌培養(yǎng)液，然后置于細(xì)菌培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為32 ℃，濕度為50%，培養(yǎng)48 h后使用融智生物科技青島有限公司提供的微生物鑒定質(zhì)譜系統(tǒng)(規(guī)格：Quan TOFⅠ/Ⅱ)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)：48 h后器皿內(nèi)出現(xiàn)典型菌落，鑒定為念珠菌。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測結(jié)果62例患者經(jīng)陰道分泌物核酸雜交法檢測診斷出念珠菌性陰道炎48例，其他類型細(xì)菌感染14例，檢出率為77.42%；熒光定量PCR檢出念珠菌性陰道炎46例，其他類型細(xì)菌感染11例，誤診5例，檢出率為74.19%；細(xì)菌培養(yǎng)法檢出念珠菌性陰道炎34例，其他類型細(xì)菌感染8例，誤診20例，檢出率為54.84%。熒光定量PCR檢出率與核酸雜交法診斷檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.176，P=0.675)；熒光定量PCR檢出率高于細(xì)菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.072，P=0.024)。見表1、2。

表1 熒光定量PCR診斷結(jié)果(n)

表2 細(xì)菌培養(yǎng)法診斷結(jié)果(n)

2.2 診斷價(jià)值熒光定量PCR檢測的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確性[95.83%(46/48)、78.57%(11/14)、91.94%(57/62)]均高于細(xì)菌培養(yǎng)法[70.83%(34/48)、57.14%(8/14)、67.74%(42/62)](均P<0.05)。

3 討論

念珠菌性陰道炎是臨床較常見的一種陰道炎類型，常伴有外陰瘙癢、尿痛、白帶增多、分泌物異味等臨床癥狀，對患者生活影響較大[3]。細(xì)菌培養(yǎng)法是目前臨床運(yùn)用較為廣泛的一種細(xì)菌鑒別技術(shù)，可以鑒別感染性疾病的菌群種類，但臨床耗時較長，往往需要2～3 d才能得出診斷結(jié)果，不能滿足臨床治療要求。熒光定量PCR診斷技術(shù)是由傳統(tǒng)PCR技術(shù)發(fā)展而來的一種新型診斷技術(shù)，應(yīng)用廣泛，可對多種病原菌進(jìn)行診斷，效果較好[4]。

本研究中熒光定量PCR檢出率與核酸雜交法診斷檢出率相近，熒光定量PCR檢出率、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確性均高于細(xì)菌培養(yǎng)法，表明相對比細(xì)菌培養(yǎng)法，熒光定量PCR診斷念珠菌性陰道炎效果更好，結(jié)果更準(zhǔn)確，臨床應(yīng)用價(jià)值更高。熒光定量PCR在檢測過程中，將熒光基團(tuán)加入PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號積累對整個PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測，然后與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比得出檢測結(jié)果。熒光定量PCR對樣本量要求較低，無需過多的樣本容量，檢測靈敏度、特異度均較高，且檢測耗時短，當(dāng)天即可獲得檢測結(jié)果，從而縮短檢測結(jié)果等待時間，可及時進(jìn)行治療[5]。與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，無PCR后續(xù)操作流程，降低產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)性，同時熒光定量PCR具有數(shù)千種細(xì)菌的熒光對照譜，對念珠菌的特異度較高；而細(xì)菌培養(yǎng)法易受到外部細(xì)菌的影響，造成診斷結(jié)果誤差，對念珠菌的特異度并不高；而對于部分細(xì)菌培養(yǎng)法無法進(jìn)行培養(yǎng)或培養(yǎng)要求較高的特殊菌種，熒光定量PCR檢測也提供了新的思路，為臨床診斷提供新的診斷方法，臨床醫(yī)生可靈活選擇運(yùn)用。因此，熒光定量PCR的診斷結(jié)果較可靠，但對操作人員的素質(zhì)要求較高，需熟悉各項(xiàng)流程的操作事項(xiàng)[6]。

綜上所述，熒光定量PCR診斷念珠菌性陰道炎效果較好，值得臨床推廣應(yīng)用。