Ki-67、CK5/6、P53、P63的表達與食管鱗癌發生發展及臨床病理特征的相關性

高攀，楊琛擘，余偉，趙鵬程，趙莉莉，王富強，申培紅

(1.鄭州大學附屬腫瘤醫院 a.臨床病理中心;b.外科，河南 鄭州 450008；2.河南大學第一附屬醫院 腫瘤內科，河南 開封 475000；3.安陽市腫瘤醫院 病理中心，河南 安陽 455000)

我國食管癌發病雖有明顯的地區差異，但食管癌病死率均較高。近年來食管癌發病率有所下降，但死亡率一直位居第4位[1]。據最新流行病學調查結果顯示我國食管癌發病率和死亡率均高于西方國家[2]。食管腺癌在北美和歐洲的發病率呈上升趨勢，但食管鱗狀細胞癌仍是世界范圍內食管癌的主要組織學類型[3]。食管鱗癌是一種惡性腫瘤，發病率高，預后差。因此，尋找能夠篩選提示鱗癌的分子標志物對食管鱗癌的防治具有重要意義。細胞角蛋白5/6(cytokeratin5/6，CK5/6)已被證實為三陰性乳腺癌的特征性分子標記物，在基底層細胞中特異性表達。Ki-67是一種在靜止期細胞中不表達的非組蛋白，只能在細胞增殖期被檢測到，反映細胞的增殖活性。P53是一種抑癌基因，50%以上腫瘤的發生發展都伴有P53的突變或異常表達。P63與P53基因具有高度同源性，主要存在于移行上皮與鱗狀上皮的基底細胞中。CK5/6、Ki-67、P53、P63之間的關系如何，目前國內的研究相對較少。本研究通過探討CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鱗癌患者中的表達及彼此間的相關性，分析其與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關系，為其在提示食管鱗癌預后和風險分級中的應用奠定基礎以及為食管鱗癌新一代靶向藥物的研發提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017年1月至2019年4月安陽市腫瘤醫院及鄭州大學附屬腫瘤醫院病理中心確診的3 200例食管癌患者的病歷資料。根據食管癌診療標準(2019版)，組織學分型使用2010版消化系統腫瘤WHO分類，經病理活檢診斷為食管鱗癌、食管非鱗癌(腺癌、癌肉瘤、印戒細胞癌、神經內分泌癌、上皮內瘤變等)。剔除合并其他腫瘤和缺失病歷或病理資料的446例患者，2 754例患者中篩選出均未接受Ki-67、CK5/6、P53、P63病理檢測的2 215例患者，最終539例患者納入研究。根據2018年常見腫瘤AJCC食管癌/食管與胃食管交界處腫瘤分期(第八版)統計食管癌患者病理的浸潤深度、區域淋巴結以及是否有遠處轉移情況，進行TNM分期，將其分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。組織學分級：鱗狀細胞癌和腺癌依據分化程度分為高分化(G1)、中分化(G2)、低分化(G3)以及分級情況不確定和無法評估(Gx)。食管鱗癌(271例)：男188例，女83例；年齡43～87歲，平均(64.85±7.53)歲；TNM分期為0期2例，Ⅰ期47例，Ⅱ期98例，Ⅲ期107例，Ⅳ期17例；組織學分級為Gx期18例，G1期27例，G2期109例，G3期117例；淋巴結轉移情況為N0(無淋巴結轉移)139例，N1(1～2個淋巴結轉移)63例，N2(3～6個淋巴結轉移)54例，N3(≥7個淋巴結轉移)15例。食管非鱗癌(268例)：男205例，女63例；年齡29～91歲，平均(66.03±7.84)歲；TNM分期為0期0例，Ⅰ期24例，Ⅱ期86例，Ⅲ期122例，Ⅳ期36例；組織學分級為Gx期69例，G1期5例，G2期82例，G3期112例；淋巴結轉移情況為N0104例，N160例，N268例，N336例。

1.2 納入及排除標準納入標準：(1)被安陽市腫瘤醫院及鄭州大學附屬腫瘤醫院病理中心確診為食管癌(鱗癌和非鱗癌)；(2)取患者部分食管、部分胃及區域淋巴結進行活檢；(3)不伴有其他重要器官嚴重病變，如心、肺功能不全；(4)患者有完整的病理及臨床資料。排除標準：(1)未經病理中心檢查的病例；(2)病理、臨床資料不完善及缺少本研究所需指標的患者。

1.3 檢測方法免疫組化染色：將所有標本制成常規組織石蠟切片后，采用streptavidin- peroxidase(SP)免疫組織化學法進行染色。抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司。結果判定如下。CK5/6陽性細胞為在細胞質中出現棕黃色或黃色顆粒的腫瘤細胞；標本中隨機選取10個高倍鏡視野(×400)，平均陽性細胞率≥5%記為(+)，<5%記為(-)。Ki-67陽性細胞為細胞核呈棕黃色或黃色顆粒的細胞，取任意10個高倍視野(×400)，平均陽性細胞數≤10%為陰性(-)，>10%為陽性(+)。P53、P63以細胞核出現黃褐色顆粒為陽性細胞，P53、P63以陽性細胞數≤10%為陰性(-)，陽性細胞數>10%為陽性(+)。由病理中心兩名高級別職稱的醫生采用獨立雙盲觀察免疫組織化學染色切片，判斷細胞的染色強度。

2 結果

2.1 食管鱗癌和食管非鱗癌患者臨床指標539例腫瘤標本中，實際獲得455例Ki-67檢測結果，其中Ki-67陽性表達427例，占93.8%，陰性表達28例，占6.2%。143例CK5/6檢測結果，其中陽性表達112例，占78.3%，陰性表達31例，占21.7%。359例P53檢測結果，其中陽性表達261例，占72.7%，陰性表達98例，占27.3%。308例P63檢測結果，其中陽性表達259例，占84.1%，陰性表達49例，占15.9%。食管鱗癌和食管非鱗癌患者神經侵犯、脈管癌栓、淋巴結轉移、TNM分期、組織學分級、CK5/6、Ki-67、P63比較，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 食管鱗癌和食管非鱗癌患者臨床指標比較[n(%)]

2.2 Ki-67、CK5/6、P53、P63表達與食管鱗癌患者臨床指標的關系食管鱗癌中231例Ki-67檢測結果中陽性表達207例，占89.6%，陰性表達24例，占10.4%。98例CK5/6檢測中陽性表達93例，占94.9%，陰性表達5例，占5.1%。144例P53檢測中陽性表達98例，占68.1%，陰性表達46例，占31.9%。244例P63檢測中陽性表達235例，占96.3%，陰性表達9例，占3.7%。在食管鱗癌中，P53與TNM分期有關(P<0.05)，與年齡、性別、脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移、組織學分級均無關(均P>0.05)；Ki-67、CK5/6、P63與年齡、性別、脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移、TNM分期、組織學分級均無關(均P>0.05)。見表2。

2.3 食管鱗癌中CK5/6、Ki-67、P53、P63的相關性Spearman相關性分析顯示，在食管鱗癌中，CK5/6與Ki-67、P53與P63、CK5/6與P53、CK5/6與P63、Ki67與P53、Ki-67與P63在食管鱗癌中的表達均呈正相關(r1=0.920、r2=0.741、r3=0.645、r4=0.967、r5=0.724、r6=0.939，均P<0.05)。

3 討論

食管癌屬于消化道系統的惡性腫瘤，根據組織學類型分為鱗癌、腺癌、小細胞未分化癌和癌肉瘤等，其中鱗癌最為常見[3]。食管鱗癌分子標記物較多，缺乏特異性，各腫瘤分子標記物之間的相關性研究較少。本研究以CK5/6、Ki-67、P53、P63 4種腫瘤分子標記物為中心，探討4種腫瘤標記物與食管鱗癌各臨床指標以及自身之間的相關性。研究發現，CK5/6、P63是鱗癌中常用的標記物，在原發性肺鱗癌中CK5/6的敏感性略高于P63，特異性與P63相似，在轉移性肺鱗癌中CK5/6和P63的敏感性相同，但CK5/6的特異性高于P63[4]。Shibata等[5]研究發現，P53、Ki-67與食管鱗癌淋巴結的轉移相關。不同的病理類型，治療方案不同。本研究中納入CK5/6、Ki-67、P53、P63 4個研究指標，結果顯示，與食管非鱗癌相比，食管鱗癌中CK5/6、Ki-67、P63表達水平較高，表明食管鱗癌預后差，死亡率高及這3項指標聯合檢測可用于區分食管鱗癌與非食管鱗癌，用于指導臨床用藥。P53與TNM分期相關，說明Ⅲ～Ⅳ期P53陽性率高于0～Ⅱ期，即P53可用于預后評判，其與食管癌的發生發展存在一定聯系，還需大量臨床研究進一步證實。

食管鱗癌是食管癌組織學分型的一種，屬于預后不良的惡性腫瘤之一，5年生存率不足30%[6]。CK5/6主要表達在皮膚的基底細胞、棘層細胞和部分前列腺基底細胞，于其他單層腺上皮不表達，常用于三陰性乳腺癌的研究，較少用于食管鱗癌的研究。有研究表明，CK5/6的表達可以作為乳腺癌的預后標志物[7]，CK5/6陽性為乳腺癌預后差的標志[8]。目前研究對于CK5/6與年齡、腫瘤大小、組織學分級、臨床分期的相關性仍存在爭議[9]。本研究中CK5/6與患者年齡、性別、脈管癌栓、神經侵犯、淋巴結轉移、TNM分期、組織學分級均無關，在食管鱗癌中也證實了這一點，還需進一步增加樣本量來提高可靠性。

表2 Ki-67、CK5/6、P53、P63表達與食管鱗癌患者臨床指標的關系

注：回顧性研究存在部分檢測數據缺失。

Ki-67是一種能有效反映細胞增殖的標志物，位于細胞核內，在細胞增殖的過程中表達，有絲分裂期達到峰值，靜止期的細胞不表達。據研究報道，Ki-67可以作為評價化療敏感性的標志物[10-12]。研究發現，Ki-67與臨床病理特征及患者預后具有顯著的相關性[13-15]。在本研究中食管鱗癌患者雖然高表達Ki-67，但Ki-67與臨床病理特征無相關性。目前Ki-67的臨界值無法統一，為1%～35%，僅St.Gallen共識就進行了4次調整[16-19]，這可能是導致研究結果不一致的原因之一。本研究數據較少，且食管癌存在明顯地區差異，故仍需要大量研究進一步證實。

P53基因是一種抑癌基因，它與多種惡性腫瘤的發生、發展有明顯的相關性。研究表明，在所有惡性腫瘤中，該基因的突變率約為50%[20]。Huang等[21]研究發現，P53基因突變后，腫瘤的侵襲力增強，這可能表明P53與分期存在相關性。由于P53改變是食管鱗癌治療反應和生存的良好預測因子，P53正常的患者5年生存率高于P53突變患者[22]。本研究中P53的表達與臨床TNM分期有關，即Ⅲ～Ⅳ期的食管癌患者P53的陽性表達高于0～Ⅱ期的患者，進一步表明P53與腫瘤預后相關。目前，以P53為靶點的研究已成為治療癌癥的焦點。有研究表明，化學物質與P53靶標組合為治療藥物可以增強對P53突變腫瘤的功效，并減少對正常細胞和組織的毒副作用[23]。本研究中，P53在食管鱗癌與食管非鱗癌患者中表達無顯著差異，表明P53無論在食管鱗癌還是食管非鱗癌中均呈高表達，不可用于食管癌的鑒別診斷，但為靶向藥物的研發提供依據。

P63表達于上皮組織基底層，在正常上皮組織的形成中發揮重要作用，P63在鱗狀細胞源性的各種良惡性腫瘤組織中均表達，尤其在鱗狀細胞癌組織中表達增強，且表達頻率及分布與鱗癌細胞間變程度顯著相關[24]。本研究中P63在食管鱗癌與食管非鱗癌患者中表達存在顯著差異，可與CK5/6、Ki-67聯合檢測用于食管鱗癌的診斷。

周晨陽等[9]研究發現，在三陰性乳腺癌腫瘤組織中CK5/6、Ki-67呈正相關，CK5/6與P53、P63無相關性，Ki-67與P53、P63無相關性，與本研究結果不相符。這可能與本研究為回顧性分析，所選資料存在選擇性偏倚或不同腫瘤中其腫瘤分子標志物表達不同有關。本研究發現，CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鱗癌中的表達均呈正相關，反映了CK5/6、Ki-67、P53、P63在食管鱗癌中表達的一致性，利于食管鱗癌預后的評估及風險分級，或許聯合應用能夠增強檢測食管鱗癌的敏感性及特異性。

由于食管非鱗癌較為少見，尚未在食管非鱗癌中對CK5/6、Ki-67、P53、P63進行相關分析，這也是需要進一步探討的問題，希望能對食管鱗癌的鑒別診斷和危險分級提供參考，對研究食管靶向藥物提供依據。