湖南中部地區住院結核病患者主要流行菌株及耐藥情況

陳偉 劉紅波 肖小紅 吳瑩

結核分枝桿菌作為與人類共同進化最為成功的病原體之一，感染了世界1/4 的人口。2017年，世界新發結核病900 萬例，130 萬例死亡（包括30萬艾滋病毒感染者），而我國新發結核病例占世界的9%，耐藥結核占世界的13%[1～3]，目前結核病的疫情和防控形勢十分嚴峻。結核病是由結核分枝桿菌引起的，以氣溶膠形式通過呼吸道在人與人之間傳播。結核分枝桿菌在環境中分布廣泛，不產生毒素，具有特殊的細胞壁結構，含豐富的脂質，對外界環境和藥物有很強的抵御能力。本研究擬通過收集在我院傳染科住院治療的結核病患者資料和痰液標本，了解本地區結核病的主要流行菌株和耐藥情況，為本地區的結核病防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2016年10月～2019年10月在我院傳染科住院治療的痰涂陽性結核病患者217例，收集患者基本資料（性別、年齡、病史等），并于清晨采集痰液進行分離培養：痰液中加入4%氫氧化鈉充分溶解，并均勻接種于酸性羅氏培養基上，37℃溫箱培養3～4 周。

1.2 主要試劑與儀器異煙肼（H）、利福平（R）、鏈霉素（S）、乙胺丁醇（E）、7H9 液體培養基購自美國Sigma公司；分枝桿菌酸性羅氏培養基及藥敏實驗培養基由本實驗室自行制備；Tap DNA 聚合酶、dNTP、引物購自大連寶生物科技有限公司；TGradinent PCR 儀購自美國Bio-RAD公司；電泳儀及凝膠電泳成像系統購自北京君正醫療設備有限公司。國際標準株H37Rv作為參照菌株（中國疾病預防控制中心提供）。

1.3 藥物敏感性試驗采用比例法進行藥物敏感試驗，取分離培養2～3周的新鮮菌落，加入含0.5%吐溫-80 的生理鹽水中，充分混勻，與標準麥氏比濁管（MacFarland No.1）比濁，配成1mg/ml 的菌液濃度。用22 SWG 的標準接種環配成2～10mg/ml 菌液，均勻接種于含異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇的培養基表面，置于37℃培養箱中，4 周后觀察結果。

1.4 結核分枝桿菌總DNA提取采用熱裂解法提取總DNA，從分離培養基上刮取適量菌體溶于蒸餾水，漩渦振蕩器上振蕩使菌落溶解均勻。于80℃滅活30min，8 000r/min 離心。棄上清后加400μl TE混勻，100℃ 30min，離心后取上清，-20℃保存備用。

1.5 “北京家族”菌株的鑒定采用RD105 缺失基因檢測法鑒定“北京家族”菌株，上游引物F：5'-CG TGCACAGTTGCGTGTGTA-3'；下游引物R：5'-CGT CGTATTCTGCCGATACT-3'。PCR擴增產物長度為266bp。PCR反應體系：Tap DNA 聚合酶0.5μl，dNTP 2.0μl（2.5mmol/L），引物各0.5μl，模板DNA 2.0μl，Buffer 2.5μl。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，70℃ 45s，共40個循環；72℃延伸10min。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 檢測陽性說明存在RD105 基因，缺失則為“北京家族”菌株。

1.6 統計學方法采用SPSS 19.0 軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，進行t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RD105缺失基因檢測法鑒定結果PCR擴增產物長度為266bp，1號為國際標準株H37Rv，2～5號為“北京家族”菌株，6號為非“北京家族”菌株，見圖1。

圖1 RD105 缺失基因檢測法鑒定“北京家族”菌株

2.2 痰涂陽性住院患者基本資料本地區住院治療的結核病患病人群以老年男性（＞60歲）為主，男性患病率明顯高于女性，為女性的2.24倍。本地區結核分枝桿菌流行菌株為“北京家族”基因型（66.8%），“北京家族”基因型流行趨勢在年齡、性別、初治和復治患者中差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 住院治療的結核病患者基本情況[n（%）]

2.3 臨床分離株耐藥情況217例臨床分離株中總耐藥率為37.8%，其中耐鏈霉素（S）24.9%、耐異煙肼（H）23.5%、耐利福平（R）16.6%、耐乙胺丁醇（E）9.2%、耐多藥（Multi-drug resistant，MDR）10.6%，耐藥和耐多藥在“北京家族”和非“北京家族”之間比較無差異，復治患者耐單藥和耐多藥率明顯高于初治患者（P＜0.05）。見表2。

表2 217例臨床分離株耐藥情況

3 討論

隨著抗結核藥物的大量使用，結核分枝桿菌在不斷的進化以適應新的宿主環境，由于治療不規范、不徹底導致耐藥菌株不斷出現，同時單耐藥菌株向多耐藥、耐多藥和廣泛耐藥轉變。這些耐藥菌株的出現給臨床治療帶來巨大挑戰，同時也增加了防控難度，因此了解本地區結核病的流行情況及耐藥情況對本地區的結核防治具有重要意義。“北京家族”菌株是世界范圍內廣泛流行的結核分枝桿菌分型，約占全部菌株的1/3，具有傳播能力強、毒力高等特點[4，5]。在我國，大部分地區的報道感染率超過50%，尤其在北方地區高達90%以上。本研究顯示：湘中地區“北京家族”菌株占全部臨床分離株的66.8%，處于全國平均水平。“北京家族”菌株與耐藥的相關性一直是結核病研究領域的熱點。但研究結果并不一致，有研究認為“北京家族”與異煙肼、利福平以及MDR 耐藥有關[6～8]，另外的研究發現非“北京家族”與鏈霉素耐藥相關[9，10]，也有觀點認為“北京家族”菌株與耐藥無關[11]。本研究未發現“北京家族”與耐藥有相關性，可能與樣本量過少、藥物敏感性檢測的主觀因素影響過大有關，下一步研究可以從基因耐藥和“北京家族”菌株的相關性入手進行探討。另外“北京家族”菌株與患者性別、年齡及治療史均無明顯相關性。

世界衛生組織報道2017年全世界新發結核病例男性為580 萬，女性為320 萬，男性和女性在結核病患病率上有明顯差異，男性約為女性的1.81倍，其中俄羅斯達到4.93倍，大部分地區為0.8～1.13倍[12]。本研究發現在本地區結核病患者中男性為女性的2.24倍，高于世界平均水平。目前認為吸煙和飲酒可能是男性結核病患病率高的原因之一，WHO 報告顯示20%的結核病患者有吸煙史，多項病例對照研究發現吸煙者的患病風險是非吸煙者的2.28～2.74倍[13～16]。有關飲酒與結核病的研究表明，在調整教育和吸煙的影響因素后，飲酒者的患病風險是非飲酒者的1.5倍[17]。最新的研究發現女性的中性粒細胞中平均表達水平較高的基因（n=682）與免疫反應和相關通路有關，而男性平均表達增加的基因（n=2 675）主要涉及細胞基本的生命過程，如RNA 轉錄和翻譯[18，19]。女性通常表現出比男性更強的免疫力，這也可能是女性結核病患者數低于男性的重要原因之一。

藥敏結果顯示，本地區結核分枝桿菌臨床分離株對一線抗結核藥物的總耐藥率為37.8%，其中耐鏈霉素（S）24.9%、耐異煙肼（H）23.5%、耐利福平（R）16.6%、耐乙胺丁醇（E）9.2%、耐多藥10.6%，本地區總耐藥率處于湖南省結核耐藥平均水平，略高于全國耐藥水平[20，21]。復治患者的總耐藥率、單一耐藥率、MDR 耐藥率明顯高于初治患者。直接督導短程化療（Directly observed treatment for short course，DOTS）是世界衛生組織推薦的結核病控制策略，能夠有效解決不合理、不規律用藥問題，有效減少耐藥結核病的產生。臨床醫生應嚴格按照DOTS 原則，管理和督促結核病患者，避免耐藥性的產生，有效降低復治患者的耐藥率。