調控Sonic Hedgehog信號通路對急性腦缺血大鼠血管再生影響的實驗研究*

朱美霖，白宏英

1.山東省濟寧市第一人民醫院老年醫學科(濟寧 272000)；2.鄭州大學第二附屬醫院神經內科(鄭州450000)

腦缺血后的血管再生可有效改善缺血半暗帶的血液供應，增加營養物質及氧氣的輸送，為新生神經元提供營養支持，并促進腦缺血恢復。腦缺血發生后雖可以代償性生成新生血管，建立側枝循環，仍不能完全代償腦缺血損傷[1]。因此腦缺血后盡快恢復血供，可以明顯改善預后。Kusano等[2]研究表明Sonic Hedgehog(SHH)信號通路可誘導血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor VEGF)、血管生長素(Angiogenin,ANG)合成促進血管再生。Renault 等[3]發現SHH信號通路可促進毛細血管形態的發生，誘導血管內皮細胞遷移。在大鼠腦缺血模型中可觀察到SHH信號通路的激活，另外有研究表明在糖尿病外周神經病變的大鼠模型中加入外源性SHH蛋白可促進血管再生[4]。為進一步研究SHH信號通路與血管再生的影響，本次研究采用Purmorphamine作為SHH信號通路的激活劑，Cyclopamine作為SHH信號的抑制劑來調控SHH信號通路，以了解SHH信號通路對腦缺血大鼠血管新生的影響。

材料與方法

1 材 料 Purmorphamine粉劑購于上海凱試公司，Cyclopamine購于美國Sigma公司，VEGF抗體、堿性成纖維細胞生長因子(FGF)兔抗鼠多克隆抗體購于美國SANTA CRUZ公司，免疫組化相關試劑盒及PCR相關試劑盒購于德國QIAGEN公司。

2 實驗動物及分組 選取健康清潔級成年SD雄性大鼠120只，體重約為260～320 g，該實驗動物由河南省實驗動物中心提供。將選中的大鼠隨機分為假手術組(n=30)、模型組(n=30)、激動劑組(PM組，n=30)、抑制劑組(CYC組，n=30)。其中模型組、激動劑組、抑制劑組按時間點再分成三個亞組，每個亞組10只大鼠。模型組、激動劑組于術后腹腔注射Purmorphamine溶液，抑制劑組于術后腹腔注射Cyclopamine溶液，剩余分組給予同等劑量的DMF溶液腹腔注射。

3 試劑配備 Purmorphamine粉劑使用前先給予二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解，粉劑全部溶解后加入PBS溶液進行稀釋。Cyclopamine粉劑使用前給予DMSO溶劑溶解，然后給予PBS溶液進行稀釋。將配備好的溶液冰箱儲存，使用前提前拿出進行復溫。

4 模型制備 采用改良線栓法制作SD大鼠永久性腦缺血模型[2]。各組大鼠給予水合氯醛腹腔注射麻醉，室溫保持 37 ℃。模型組及給藥組給予分離頸總動脈及頸內動脈，夾閉頸總動脈，距離分叉處4 mm插入制備好的線栓，將線栓插入大腦中動脈，固定線栓，縫合。術中大鼠體溫保持37 ℃，術后大鼠單籠飼養。參照Zea longa評分標準于大鼠清醒后6 h、24 h、72 h對造模大鼠進行神經功能缺損評分。其中1～3分且無蛛網膜下腔出血視為造模成功。不符合評分標準剔除，取同批次補足，以保證每個亞組10只大鼠。

5 免疫組化法和微血管密度 于造模給藥結束后按照既定的時間點腹腔注射10%水合氯醛麻醉，4%甲醛快速心臟灌洗，斷頭取腦固定24 h備用，經過石蠟包埋后，切成4 μm厚度的切片。每只大鼠冰凍切片隨機抽取5張，嚴格按照說明書進行免疫組化染色、DAB顯色和封片。采用圖像測量分析軟件測定VEGF、成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor，FGF)表達的平均光密度(MOD)。根據Longa等[5]改良血管計數法，染色棕黃且與周圍周圍細胞分界清楚作為一個計數單位，計算CD34微血管密度、微血管數。

6 PCR測定缺血半暗帶區域膠質瘤相關癌基因1(GLI1)mRNA的表達情況 10%水合氯醛麻醉，取出腦組織，液氮冷藏后放置于-80℃冰箱。取皮層腦組織100 mg，按照說明書提取總RNA，將RNA逆轉錄合成相互補的cDNA，以cDNA為模板進行擴增建立PCR反應體系。GLI1上游引物為：5’-TATGTTCTGGCTGCTGCTGTTG-3’下游引物為5’-TGACGCATTGCTGAATCTAA-3’。其中擴增條件為：94 ℃預變性2 min，1個循環；94 ℃變形30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環，72 ℃延伸6 min。將擴增好的產物及Maker進行電泳，使用圖像分析系統進行半定量分析，試驗中以β-actin為內參，GLI1的擴增片段長度為170 bp，計算GLI1相對表達量。

結 果

1 大腦皮質半暗帶區CD34新生微血管密度 CD34陽性細胞大部分分布在缺血半暗帶區。PM組新生血管密度較模型組、CYC組明顯增多，三組差異具有統計學意義(P<0.05)。CYC組新生血管密度較模型組、CYC組明顯減少(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠腦組織新生血管密度表達

2 缺血皮層區VEGF的表達 胞質中沉著棕黃色顆粒即為VEGF陽性表達，VEGF表達主要集中在損傷皮層及缺血周圍。模型組6 h可見VGFE表達升高，72 h最多。PM組VEGF的表達量較模型組、CYC組明顯增多，比較差異具有統計學意義(P<0.05)。CYC組VEGF的表達量較PM組、模型組明顯減少，比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2(圖1)。

表2 大鼠腦組織VEGF的表達

3 FGF的表達 FGF陽性細胞常見于血管內皮細胞、神經細胞、膠質細胞等，模型組6 h FGF弱表達，72 h表達最多。PM組FGF的表達量較模型組、CYC組明顯增多，比較差異具有統計學意義(P<0.05)。且CYC組FGF的表達量較PM組、模型組明顯減少，比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3(圖2)。

表3 大鼠腦組織FGF的表達

4 PCT檢測GLI1的表達 與模型組相比較，PM組各時間點GLI1的表達量較前明顯增多(P<0.05)，與模型組相比較，CYC組各時間點GLI1的表達量較前明顯減少。見表4。

表4 大鼠腦組織 GLI1的表達

注：A：假手術組；B：模型組；C：PM組；D：CYC組

討 論

在腦缺血性疾病中，神經血管單元因為缺氧缺血出現壞死凋亡，影響神經功能恢復，因此及時恢復血供，促進血管新生成為研究治療的熱點。早期研究表明SHH信號通路與胚胎發育有關，近期研究表明SHH信號通路在血管再生起著重要作用[6]。Kusano 等[4]發現 SHH信號通路誘導局部缺血組織血管再生，且誘導血管新生的能力強于VEGF。在參與血管再生的過程中，SHH信號通路可以通過依賴GLI的通路、PI-3激酶通路進行調控[7]。SHH信號通路中通過smo蛋白與ptch結合激活下游基因GLI轉錄因子，誘導目的基因的表達。GLI鋅指家族轉錄因子包含GLI1、GLI2、GLI3，其中GLI1的表達在SHH信號通路中扮演了啟始開關的角色。GLI1是目前發現的最能反映 SHH信號通路激活的指標[8]。因此本次研究選取測定GLI1的表達反映通路是否被激活。

Purmorphamine作為SHH信號通路的激活，是一種小分子的嘌呤物，可以透過血腦屏障。Purmorphamine與SMO蛋白結合改變其空間構象從而激活SHH信號通路。本研究顯示PM組在腦缺血6 h后GLI1的表達量較假手術組、模型組有明顯升高，24 h達高峰，72 h仍維持在較高水平，這就表明腹腔注射Purmorphamine可以外源性激活SHH信號通路。Cyclopamine是SHH信號通路的抑制劑，作用位點為SMO蛋白，可改變SMO蛋白構象使SMO蛋白失活，抑制SHH信號通路。有研究表明SHH信號通路在腦缺血急性期可被激活，阻斷內源性激活的SHH信號通路可加重腦缺血。本次研究中模型組6 h后GLI的表達開始升高，表明在腦缺血急性期存在內源性激活。腹腔注射Cyclopamine后該組GLI1的表達量與模型組、PM組相比較有明顯降低，說明激活的SHH信號通路被Cyclopamine抑制，從而阻斷下游基因的表達。

內皮血管生長因子VEGF是目前發現的最強的血管通透性因子，可以誘導其毛細血管新生，并且特異性地作用于血管內皮細胞，從而促進細胞分裂、促進血管新生、側支循環的建立。有研究表明VEGF基因治療缺血性疾病可促進缺血組織器官的血管重建,改善缺血組織供血,為缺血性疾病的治療開辟了一條嶄新的途徑[9]。ANG是新生血管構建過程中重要的組成成分,在構建新生血管過程中發揮著關鍵的作用[10-11]。SHH信號通路可誘導 VECs 分化、增殖和遷移，促進毛細血管管腔形成[12]，VEGF被認為是SHH信號通路的下游靶基因。堿性成纖維因子FGF可以促進血管基底細胞及間質細胞分裂，還能通過分泌膠原酶降解細胞外基質和血管基底膜，從而促進血管再生[13]。SHH信號通路可通過誘導 FGF 表達，促進血小板衍生生長因子及ANG的表 達，間 接 誘 導 血 管 新 生[14-15]。本研究中模型組、PM組的各時間點VEGF、FGF的表達量較前假手術組、CYC組明顯增多，說明不管內源性激活SHH信號通路，還是外源性激活SHH信號通路，均可上調VEGF、FGF的表達促進血管再生。并且PM組新生血管密度、VEGF、FGF的表達量較其余組明顯增多，而CYC組的新生血管密度、VEGF、FGF的表達量較其他組減少，這就說明腹腔注射Purmorphamine可激活SHH信號通路上調VEGF、FGF的表達促進血管再生。腹腔注射Cyclopamine后可抑制SHH信號通路下調VEGF、FGF的表達抑制血管再生。

總之通過本實驗研究表明激動SHH信號通路可上調VEGF、FGF的表達促進血管再生，反之抑制SHH信號通路下調VEGF、FGF的表達抑制血管再生，SHH信號通路調控腦缺血后血管再生中起著重要作用。但是SHH信號通路對血管再生的作用機制、外源性激活SHH信號通路持續效應如何以及與其他通路是否有交叉作用等問題仍需要進一步研究。