啤酒花揮發油成分及其殺螨活性分析

趙娜娜，傅文佳，路 偉，古麗米熱，杜書亞

(新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】啤酒花HumuluslupulusL. 是桑科葎草屬一種多年生攀援草本植物，原產于歐洲、美洲和亞洲地區。中國新疆和四川北部均有野生資源分布，各地多有栽培，是釀造啤酒的原料，在啤酒釀造中，啤酒花具有不可替代的作用；除此之外，啤酒花還具有抗腫瘤、防治骨質疏松癥和抗氧化等功能[1]；目前對其殺蟲活性研究，僅有國外研究證明啤酒花超臨界CO2萃取物對3種倉儲害蟲谷象、雜擬谷盜和谷斑皮蠹具有拒食活性，表明啤酒花萃取物是可以作為防治倉儲害蟲的一種潛在拒食劑[2]。啤酒花具有開發為天然植物源農藥的潛力。土耳其斯坦葉螨是危害棉花、玉米、果樹、蔬菜等多種農作物的重要害螨[3-7]，在中國僅分布于新疆地區[8-11]，在新疆地區普遍發生，是北疆棉花害螨的優勢種群，給棉花生產帶來很大的影響[12, 13]。目前國內外防治土耳其斯坦葉螨的主要手段依然是化學防治，但是高毒高殘留農藥的不合理選擇和使用，對環境和生態造成污染和危害[14]。且由于土耳其斯坦葉螨繁殖速率快、世代周期短，短期內對一些常用殺蟲劑可以產生強抗性，給防治帶來了很大的挑戰，也成為制約新疆農業生產發展的關鍵因子[15]。篩選出高效、低毒、對環境友好的新型生物農藥勢在必行。研究生物殺螨劑對棉葉螨的防治效果和毒力，對棉田殺螨劑的合理使用具有指導意義[16]。【前人研究進展】植物源農藥是一類來源于植物體的農藥，其有效成分通常不是單一化合物，而是植物有機體中的一些、甚至大部分有機物質。因其具有環境友好、對非靶標生物安全、不易產生抗藥性、作用方式特異、促進作物生長并提高抗病性、種類多、開發途徑多等特點，在瓜、果、蔬菜、特種作物(茶、桑、中草藥、花卉等)及有機農業領域得到了廣泛關注和應用[17]。黃花蒿、姜黃、丁香、青蒿、側柏葉、羊蹄根、地錦、石榴籽、木鱉子、大山芝麻、沙茴香、鹽膚木、艾蒿、牽牛子、牛至子等多種植物對朱砂葉螨具有生物活性[18-33]；白花丹、紫莖澤蘭、藿香、北細辛等植物對柑桔全爪螨具有較好的生物活性[34，35]；狼毒、苦參、百部、臭椿等植物對二斑葉螨具有生物活性[36]；紫丁香、黃連木、鹽膚木、南方六道木、沙茴香和水芹等對酢漿草如葉螨具有較好的毒殺作用[37]；核桃青皮、火炬樹、河朔蕘花對山楂葉螨具有生物活性[38-40]。【本研究切入點】已有的研究報道明確了從植物中可以獲得比較理想的殺螨活性物質，為研究開發植物性的殺螨劑奠定了一定的基礎。國內外已報道了多種植物具有防治葉螨的作用，然而利用植物源提取物防治土耳其斯坦葉螨的相關研究還較少。研究啤酒花揮發油成分及其殺螨活性。【擬解決的關鍵問題】研究4種植物精油對土耳其斯坦葉螨的殺螨活性，通過水蒸氣蒸餾法提取4種植物精油，葉片浸漬法測定不同植物精油對土耳其斯坦葉螨的毒力，評價不同精油對土耳其斯坦葉螨的觸殺活性，為植物源殺螨劑的開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物

選用4種具有生物活性的植物作為研究材料，啤酒花、香青蘭、驅蟲斑鳩菊、歐洲鱗毛蕨均采自新疆維吾爾自治區。所有植物標本保存于新疆農業大學農學院昆蟲系天然產物與化學生物學實驗室。表1

表1 4種植物名錄Table 1 Four plants directory

1.1.2 供試蟲源

土耳其斯坦葉螨于2017年6月采自新疆沙灣縣棉花田的自然種群，采集前棉田未施用任何藥劑。將采集的棉葉螨接到室內種植的盆栽辣椒上，飼養多代后再挑選同一批次、大小一致的成螨作為試螨，試螨不分雌雄。

飼養條件：接種后的盆栽棉花置于人工氣候箱內，氣候箱設置溫度26～28°C，相對濕度為75%，光照黑暗時間為14 h∶8 h (L∶ D)。

1.1.3 試劑與儀器

儀器：連續蒸餾裝置，北京玻璃儀器廠；

SHZ-DIII循環水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器有限責任公司；

RE-52CS型號旋轉蒸發器：上海振捷實驗設備有限公司；

數控升降式水浴鍋：上海振捷實驗設備有限公司；

電子天平：天馬衡基FA1004；

恒溫恒濕培養箱：寧波萊福科技有限公司；

培養板：12孔細胞培養板。

試劑：正己烷(分析純)、丙酮、無水硫酸鈉：國藥集團化學試劑北京有限公司；

聚四氟乙烯：上海三愛富有限責任公司。

1.2 方 法

1.2.1 水蒸氣蒸餾法提取植物精油

通過水蒸氣蒸餾法提取歐洲鱗毛蕨、啤酒花、香青蘭、驅蟲斑鳩菊4種植物的精油。將0.5 kg曬干的植物放入到3 000 mL的圓底燒瓶，對水2 000 mL，用水蒸氣蒸餾法蒸餾3～4 h，所得油水混合物用正己烷萃取，萃取所得物用無水硫酸鈉脫水后，用旋轉蒸發器減壓蒸發濃縮(40℃)回收正己烷，所得殘留的油狀液即為精油，測比重，收集放入棕色瓶中密封保存，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2 觸殺活性測定

生測方法結合參考FAO葉片浸漬法做了一些改進，配制濃度為2%的瓊脂，將加熱后的瓊脂倒入12孔的培養板內，瓊脂高度約為0.5 cm，置于-4℃冰箱內備用。將田間采集未施藥劑的新鮮棉花葉片洗凈晾干，用直徑為2 cm的打孔器打孔待備用；以丙酮為溶劑配制4 mL的藥劑，棉花葉片在溶液中浸泡10 s后，用鑷子夾出，置于濾紙上自然揮發2 min，然后葉背朝上置于已倒好的瓊脂上，挑取10頭健康一致的成螨于葉片上，宣紙蓋在培養板上，固體膠封好，置于溫度為25℃、濕度為70%的溫箱內。24 h后，觀察和記錄試螨的死亡情況。每個濃度重復5次，每個重復10頭試螨，丙酮不加藥劑作為空白對照。用毛筆撥動螨體，螨體不動即為死亡。

死亡率(%)=100×死螨數/試螨數；

校正死亡率(%)=100×[處理組死亡率-對照組死亡率/(1-對照組死亡率)]；

半致死濃度(LC50)即引起50%土耳其斯坦葉螨死亡率的濃度，使用Probit軟件包計算得到半致死濃度。

1.2.3 GC-MS測定精油化學成分

樣品送至北京師范大學分析測試中心。

采用美國Bruker公司450GC-320MS三重四級桿氣質聯用儀，配備BP-5MS石英毛細管色譜柱(0.25 μm×0.25 mm×30 m)。EI離子源溫度210℃；傳輸線溫度250℃；進樣口溫度250℃；進樣量1 μL，分流比1∶10。升溫程序：起始溫度50℃，停留5 min，之后以10℃/min的速率升溫至290℃，停留15 min。

2 結果與分析

2.1 生物活性

研究表明，在藥劑濃度為60.00 mg/mL時，啤酒花精油的致死率高達100.00%，香青蘭致死率84.00%，驅蟲斑鳩菊、歐洲鱗毛蕨的致死率分別為48.00%、40.00%；在濃度為40 mg/mL時，啤酒花精油的致死率高達96.00%，香青蘭精油的致死率分別為78.00%，驅蟲斑鳩菊的致死率為38.00%，歐洲鱗毛蕨的致死率為8.00%；在濃度為26.70 mg/mL時，啤酒花的致死率高達88.00%，香青蘭的致死率為54.00%，驅蟲斑鳩菊的致死率為28.00%，歐洲鱗毛蕨無活性；在濃度為18.30 mg/mL時，啤酒花精油的致死率仍然高達70.00%，香青蘭、驅蟲斑鳩菊的致死率分別為26.00%、16.00%；在濃度為11.70 mg/mL時，各植物精油的活性均減弱甚至無活性，活性較好的為啤酒花精油，致死率36.00%；在濃度為8.00 mg/mL時，僅有啤酒花有較弱活性，致死率為24.00%。表2

表2 土耳其斯坦葉螨經4種精油處理24 h后校正死亡率Table 2 Correct mortality of the 4 essential oils against T. turkestani adults after 24 h(%)

注：數據為平均值±標準誤，不同小字母表示0.05水平上差異顯著
Note：Data were presented as mean±SD, data with different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level

研究表明，啤酒花、香青蘭精油對土耳其斯坦葉螨的觸殺活性較好，LC50分別為13.30、126.28(mg/mL)，驅蟲斑鳩菊精油的觸殺活性較弱，LC50為47.50 mg/mL，活性最差的是歐洲鱗毛蕨精油，LC50為83.09 mg/mL。表3

表3 4種精油對土耳其斯坦葉螨的觸殺活性Table 3 Contact toxicity of the 4 essential oils against T. turkestani adults

2.2 啤酒花精油的化學成分

啤酒花精油通過GC-MS檢測并鑒定出48個峰，其中出峰時間在20.228 min時的物質含量最高。圖1

圖1 啤酒花精油離子譜
Fig. 1 Total ion chromatogram of the essential oil fromH.lupulus

通過分析鑒定出啤酒花精油化學成分中大于1%的有28個化合物，如表4。主要成分為1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氫-γ-鉻烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)等。圖1,表4

3 討 論

室內毒力測定結果表明，土耳其斯坦葉螨對啤酒花精油很敏感，其LC50值為13.30 mg/mL；將各精油按毒力大小排序依次為：啤酒花、香青蘭、驅蟲斑鳩菊、歐洲鱗毛蕨。啤酒花精油經GC-MS鑒定，主要成分為1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氫-γ-鉻烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)，這3種化學成分很有可能是其關鍵活性成分，但還有待下一步分離純化、生物測定驗證。

目前研究多關注啤酒花在釀酒方面的作用，鮮有其殺蟲殺螨活性報道。國內僅有1篇文獻涉及植物精油對土耳其斯坦葉螨的生物活性[41]，其他大都集中在朱砂葉螨、二斑葉螨的生物活性研究方面；有文獻報道迷迭香、薄荷等精油及其主要化學成分對土耳其斯坦葉螨的熏蒸活性[42]。有必要進一步開發植物資源，為土耳其斯坦葉螨的生物防除提供理論依據；進行生物活性測定以及殺螨活性物質的分離、鑒定，為植物源殺螨劑的研制提供技術數據。殺螨植物中的活性物質一般可以直接利用，也可以通過分離純化活性植物確定關鍵活性成分，關鍵活性成分的確定可為農藥成分的合成提供先導結構，新的功能集團可延緩降低害螨的抗性發展，對活性成分進行修飾合成，為進一步研制殺螨農藥新品種奠定理論基礎。如以姜黃素為原料合成了1種苯腙類姜黃素衍生物，結果表明，姜黃素及其衍生物對柑桔全爪螨、朱砂葉螨、腐食酪螨都有不同程度的觸殺作用[43]。但是，目前對殺螨植物中活性成分分離鑒定的研究仍較少，大都集中在對殺螨植物的篩選與生物活性測定上。研究接下來要對啤酒花精油進行分離純化，以生物活性為指導進行硅膠柱層析分離，并結合核磁共振技術、質譜技術等確定活性成分的化學結構。

表4 啤酒花精油化學成分(>1%)Table 4 Chemical compositions of the essential oil from H. lupulus (>1%)

在試驗中還發現各精油的殺螨活性與殺蟲活性并不一致，如殺螨活性最好的植物是啤酒花，而殺嗜卷書虱活性最好的是椒蒿、驅避赤擬谷盜活性最好的植物卻是香青蘭，這可能與昆蟲和螨具有不同的生理構造有關，也與生物測定的方法有關，對葉螨活性好的植物對昆蟲的活性不一定好，不同的昆蟲活性也不一定一致，在篩選農藥活性化合物時, 不能一味單調的追求針對某一昆蟲的殺蟲效果或殺螨效果，而應該綜合測試植物提取物或活性化合物對不同靶標生物的活性。

4 結 論

4種參試植物中，啤酒花、香青蘭、驅蟲斑鳩菊精油對土耳其斯坦葉螨具有較好的觸殺活性，其中啤酒花精油的活性最好，有發展為天然殺螨劑的潛力。啤酒花精油通過氣相色譜-質譜聯用儀分析，主要成分為1a, 2, 5, 5-四甲基-反式-1a, 4a, 5, 6, 7, 8-六氫-γ-鉻烯(17.15%)、(S, E)-3, 7, 11-三甲基-6, 10-十二碳二烯酸甲酯(8.26%)、石竹烯氧化物(7.99%)，3種化合物都有可能是活性化合物。