李 倫,楊 陳,陳 靜
(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003)
【研究意義】雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲Monoleptahieroglyphica(Motschulsky) 屬于鞘翅目Coleoptera,葉甲科Chrysomelidae,分布于我國(guó)大部分地區(qū),主要為害玉米和棉花等多種作物[1,2]。該葉甲成蟲(chóng)取食寄主植物的葉表皮及葉肉,易形成花葉以及對(duì)葉片造成孔洞,進(jìn)而對(duì)棉花的生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[3]。近年來(lái),雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲對(duì)新疆地區(qū)的棉花等作物的危害日益嚴(yán)重,已逐漸成為部分區(qū)域棉花等作物上的主要害蟲(chóng)[4]。長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑已使該葉甲產(chǎn)生抗藥性,且污染環(huán)境[5]。尋找有效的防治方法,對(duì)利用活性化合物防治葉甲有實(shí)際意義。【前人研究進(jìn)展】昆蟲(chóng)信息化學(xué)物質(zhì)是用來(lái)影響和控制同種昆蟲(chóng)不同個(gè)體之間聚集、防御等多種行為的化合物,其中昆蟲(chóng)聚集信息素(aggregation pheromone),一般產(chǎn)生于昆蟲(chóng)個(gè)體且通過(guò)其排泄物釋放,能夠引起雌雄兩性同種昆蟲(chóng)的聚集行為[6]。鞘翅目昆蟲(chóng)聚集信息素的來(lái)源,一昆蟲(chóng)雌性體表?yè)]發(fā)物[7],二是昆蟲(chóng)糞便揮發(fā)物[8],三是昆蟲(chóng)危害誘導(dǎo)出的植物揮發(fā)物[9]。聚集信息素成分復(fù)雜,已鑒定出的鞘翅目昆蟲(chóng)聚集信息素的主要成分為一些烴、醇、醛、酮、酯、酸類(lèi)化合物,同一個(gè)科的昆蟲(chóng)聚集信息素化學(xué)結(jié)構(gòu)相差不是很大,且多數(shù)昆蟲(chóng)同屬的聚集信息素組分極為相似[6,10]。同一性別的蠹蟲(chóng)所分泌的信息素往往包括三、四個(gè)甚至更多化合物的混合物[11]。長(zhǎng)小蠹Platypus聚集信息素的化學(xué)成分主要是烯醇類(lèi)[12]。十字花科跳甲Phyllotretacruciferae聚集信息素由多種萜烯類(lèi)化合物組成的[13]。目前,昆蟲(chóng)聚集信息素主要應(yīng)用于害蟲(chóng)誘殺和蟲(chóng)情監(jiān)測(cè)等方面[14,15]。例如,從華山松木蠹象Pissodespunctatus的新鮮蟲(chóng)糞和雄蟲(chóng)后腸中發(fā)現(xiàn)的聚集信息素活性成分對(duì)華山松木蠹象表現(xiàn)出一定的引誘作用[16]。澤桑梓等[17]通過(guò)GC-MS分離鑒定出1-甲基-2-異丙烯基-環(huán)丁烷乙醇在林間引誘試驗(yàn)中對(duì)華山松木蠹象有較好的效果;范麗華等[18]也通過(guò)GC-MS分離鑒定出十八烷、十九烷、十二酸和十四酸對(duì)臍腹小蠢Scolytusschevyrewi有引誘性,并推斷其為臍腹小蠢聚集信息素的主要成分。利用昆蟲(chóng)聚集信息素對(duì)該葉甲進(jìn)行防治,是實(shí)現(xiàn)害蟲(chóng)可持續(xù)控制的一種新的有效防治途徑。【本研究切入點(diǎn)】從雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲為害玉米和棉花后誘導(dǎo)出的揮發(fā)物中,雌、雄蟲(chóng)對(duì)α-長(zhǎng)葉蒎烯、3-蒈烯、γ-萜品烯、β-紫羅酮以及月桂烯等的EAG反應(yīng)效果較好;行為反應(yīng)表明,γ-萜品烯對(duì)雄蟲(chóng)具有一定的引誘效果,β-紫羅酮對(duì)雌蟲(chóng)具有一定的引誘效果[19,20]。由于昆蟲(chóng)聚集信息素來(lái)源多樣化[21,22]。昆蟲(chóng)糞便揮發(fā)物中的一些成分可能對(duì)昆蟲(chóng)的聚集和趨避行為起著重要作用[23],已知非洲飛蝗(Locustamigratoria)蝗蝻的糞便中含有群居信息素[24]。石旺鵬等[25]對(duì)東亞飛蝗的研究表明,該蟲(chóng)活性較高的聚集信息素來(lái)源于其糞便中。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)在棉田呈聚集型分布[26],是否與其糞便揮發(fā)物起到一定的聚集作用,尚未報(bào)道。研究鑒定雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)糞便活性成分。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究通過(guò)GC-MS采集鑒定雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲糞便揮發(fā)性化合物的組分和含量,利用觸角電位儀和“Y”型嗅覺(jué)儀測(cè)定雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌、雄成蟲(chóng)對(duì)其糞便揮發(fā)物的電生理和行為反應(yīng),篩選出雙斑長(zhǎng)跗螢糞便揮發(fā)物中對(duì)該葉甲具有聚集趨性的活性化合物,為研究該葉甲的聚集信息素奠定基礎(chǔ),為利用活性化合物對(duì)該葉甲進(jìn)行綜合防治提供理論依據(jù)。
1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)采自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站棉花田及周邊雜草,在特定的養(yǎng)蟲(chóng)裝置內(nèi)用棉花葉片飼養(yǎng)該蟲(chóng),將其放入PXZ型智能培養(yǎng)箱,光照周期設(shè)置為 L∶ D = 16∶ 8,溫度為(26 ± 1)℃,備用。
1.1.2 供試儀器
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-7890A-5975C(安捷倫,美國(guó));觸角電位儀(Syntech,荷蘭) ;“Y”型嗅覺(jué)儀(主管長(zhǎng)15 cm,兩臂10 cm,內(nèi)徑均為0.7 cm,兩測(cè)試臂夾角60°)。
1.2.1 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲糞便揮發(fā)物組成的測(cè)定
在特制的養(yǎng)蟲(chóng)裝置中放入30只健康的雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng),并在底部墊濾紙和新鮮的棉花葉片,之后將裝置放入培養(yǎng)箱中,24 h后收集新鮮糞便,除雜后將糞便收集在10 mL離心管中,將其密封、稱(chēng)重、記錄,然后保存在4℃的冰箱中。試驗(yàn)參照張?jiān)鰪?qiáng)[27]的方法,采用固相微萃取法采集雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲糞便揮發(fā)物:稱(chēng)取6 g供試糞便,放入10 mL的萃取瓶中塞緊,在50℃的水浴鍋中加熱15 min,將100 μm的萃取纖維頭(PDMS)裝入萃取手柄內(nèi)活化30 min,之后將其插入萃取瓶?jī)?nèi)萃取50 min,取樣完畢后放入290℃氣化室脫附10 min。通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對(duì)采集到的雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲糞便揮發(fā)物進(jìn)行定性分析,色譜柱是PE-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm),氦氣作為載氣,流速為1 mL/se;使用手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器(SPME),進(jìn)樣口溫度為250℃;升溫程序是:起始柱溫50℃,保持3 min,再以3℃/min 升溫至200℃,5℃/min升溫至280℃保持30 min。質(zhì)譜條件為:電離源為EI,離子源溫度為230℃, GC-MS傳輸線(xiàn)溫度為200℃,質(zhì)量掃描范圍為35~600 amu,EI電離能量為70 eV。檢索普庫(kù)為Nist 2008版。
1.2.2 觸角電生理反應(yīng)
測(cè)定步驟參照劉航等[28]的方法,用眼科手術(shù)剪刀將雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)觸角從根部剪下,再除去觸角尖端1 mm,將剪好的觸角兩端搭在探頭兩端用導(dǎo)電膠固定。滴加10 μL糞便揮發(fā)物在濾紙條(35 mm×5 mm)上,將其放入1 mL的槍頭中連接混合出氣管且距離觸角1 cm,連續(xù)刺激氣體流量為500 mL/min,每次刺激1 s,間隔60 s進(jìn)行下1次刺激。每個(gè)測(cè)試樣6次重復(fù),在測(cè)試開(kāi)始和結(jié)束時(shí),用石蠟各測(cè)試1次作為對(duì)照,以校正樣品EAG值。
1.2.3 嗅覺(jué)行為反應(yīng)
測(cè)定步驟參照張志虎等[29]方法,試驗(yàn)選擇在較暗的室內(nèi)進(jìn)行,溫度為(25±1)℃,測(cè)試時(shí)在裝置上方安置2盞40 W的臺(tái)燈。裝置兩臂用Teflon管連接氣味源裝置、流量計(jì)、加濕器、活性炭過(guò)濾器、大氣采樣儀。氣體流速設(shè)為500 mL/min。供試?yán)ハx(chóng)采用饑餓處理12 h的雌、雄雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng),當(dāng)葉甲越過(guò)主管長(zhǎng)度1/2處,開(kāi)始計(jì)時(shí)并觀(guān)察其選擇性。當(dāng)該葉甲越過(guò)1/3測(cè)定臂,記為做出選擇;若3 min后無(wú)選擇趨向,記為無(wú)選擇。每頭葉甲測(cè)1次,每測(cè)5頭成蟲(chóng)后將兩臂互換位置,以消除誤差。雌、雄蟲(chóng)一組各測(cè)試20頭,重復(fù)4次,共80頭。完成后用95%乙醇清洗裝置,晾干待用。
利用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析和Duncan多重比較,雌、雄蟲(chóng)對(duì)同一揮發(fā)物EAG反應(yīng)值的差異顯著性采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。
嗅覺(jué)行為反應(yīng)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)在2個(gè)氣味源間的選擇結(jié)果是否呈假設(shè)40∶40的理論分布,并且計(jì)算χ2值和相應(yīng)的顯著性水平P值。
研究表明,從雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)糞便的揮發(fā)物中檢測(cè)出29種化合物,其中揮發(fā)性成分以酯類(lèi)化合物居多,約占69.28%;酮類(lèi)、酚類(lèi)和醛類(lèi)化合物所占比例較少;烯類(lèi)化合物中(Z)-γ-紅沒(méi)藥烯、α-石竹烯和α-蒎烯等含量較多;醇類(lèi)化合物中1-十四烷醇、1-十七烷醇和α-紅沒(méi)藥醇為主要成分;烷類(lèi)化合物中十八烷和十九烷居多;酸類(lèi)化合物為壬酸和棕櫚酸且含量較少。單一化合物中總含量最高的為己二酸二辛酯,占總含量的55.30%,其次為鄰苯二甲酸-2-戊酯丁酯占總含量的7.04%。表1
研究表明,從29種化合物中選取α-蒎烯、α-紅沒(méi)藥醇、α-石竹烯、棕櫚酸來(lái)測(cè)定雌、雄雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)對(duì)這4種揮發(fā)物的10、1、10-1和10-2μL/mL 4個(gè)濃度的EAG反應(yīng)。表2
2.2.1 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雄成蟲(chóng)對(duì)4種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)
雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雄蟲(chóng)對(duì)10、1、10-1和10-2μL/mL 4個(gè)濃度的α-蒎烯,10 μL/mL濃度的α-紅沒(méi)藥醇,10和1 μL/mL 2個(gè)濃度的α-石竹烯EAG反應(yīng)效果較為明顯,對(duì)10、1、10-2μL/mL 3個(gè)濃度的棕櫚酸,10-2μL/mL的α-紅沒(méi)藥醇反應(yīng)值相對(duì)較小。在4種揮發(fā)物中,雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雄蟲(chóng)對(duì)10 μL/mL的α-紅沒(méi)藥醇反應(yīng)值最大,對(duì)α-紅沒(méi)藥醇和α-蒎烯的反應(yīng)值隨揮發(fā)物濃度的增加而增大,對(duì)α-石竹烯的反應(yīng)值隨揮發(fā)物濃度的增加先減小后增大。
2.2.2 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌成蟲(chóng)對(duì)4種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)
雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲(chóng)對(duì)10、1和10-2μL/mL 3個(gè)濃度的α-蒎烯,10、1和10-1μL/mL 3個(gè)濃度的α-紅沒(méi)藥醇,10、1和10-2μL/mL 3個(gè)濃度的α-石竹烯EAG反應(yīng)效果較為明顯,對(duì)10和1 μL/mL 2個(gè)濃度的棕櫚酸,10-1μL/mL的α-石竹烯反應(yīng)值相對(duì)較小。在4種揮發(fā)物中,雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲(chóng)對(duì)10 μL/mL的α-紅沒(méi)藥醇反應(yīng)值最大,對(duì)α-紅沒(méi)藥醇的反應(yīng)值隨揮發(fā)物濃度的增加而增大,對(duì)α-蒎烯和α-石竹烯的反應(yīng)值隨揮發(fā)物濃度的增加先減小后增大。
根據(jù)EAG反應(yīng)的結(jié)果,選取10 μL/mL的α-蒎烯、α-紅沒(méi)藥醇、α-石竹烯和10-1μL/mL棕櫚酸與對(duì)照液體石蠟進(jìn)行行為反應(yīng)測(cè)定。圖1,圖2
2.3.1 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雄蟲(chóng)對(duì)4種揮發(fā)物的嗅覺(jué)行為反應(yīng)
研究表明,在4種揮發(fā)物中,雄雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)對(duì)4種揮發(fā)物的偏好性從強(qiáng)到弱依次為α-紅沒(méi)藥醇(χ2= 7.54,P<0.01,n = 80)>α-蒎烯(χ2= 5.69,P<0.05,n = 80)>棕櫚酸(χ2= 0.17,P>0.05,n = 80)>α-石竹烯(χ2= 0.43,P>0.05,n = 80),其中α-紅沒(méi)藥醇和α-蒎烯對(duì)雄蟲(chóng)的引誘效果明顯,達(dá)到顯著性水平;棕櫚酸和α-石竹烯對(duì)雄蟲(chóng)的引誘效果不明顯,無(wú)選擇性差異。圖1

表1 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)糞便揮發(fā)物的化學(xué)成分Table 1 Volatile composition of Monolepta hieroglyphica of feces
2.3.2 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌蟲(chóng)對(duì)4種揮發(fā)物的嗅覺(jué)行為反應(yīng)
研究表明,在4種揮發(fā)物中,雌雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)對(duì)4種揮發(fā)物的偏好性從強(qiáng)到弱依次為α-紅沒(méi)藥醇(χ2= 6.30,P<0.05,n = 80)>α-蒎烯(χ2= 4.41,P<0.05,n = 80)>棕櫚酸(χ2= 0.58,P>0.05,n = 80)>α-石竹烯(χ2= 0.84,P>0.05,n = 80),其中α-紅沒(méi)藥醇和α-蒎烯對(duì)雌蟲(chóng)的引誘效果明顯,達(dá)到顯著性水平;棕櫚酸和α-石竹烯對(duì)雌蟲(chóng)的引誘效果不明顯,無(wú)選擇性差異。圖2

表2 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲對(duì)糞便中4種揮發(fā)物單品的EAG反應(yīng)相對(duì)值Table 2 Relative EAG response of Monolepta hieroglyphica of 4 kind of volatile compounds of feces
注:表中數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤,數(shù)字后字母表示同種揮發(fā)物不同濃度在P< 0. 05 水平 Duncan多重比較結(jié)果;*表示相同濃度下雌、雄蟲(chóng) EAG 反應(yīng)值差異顯著性(P< 0. 05);**表示差異極顯著性(P< 0.01)
Note:The date in the table are mean ± SE,and followed by letters indicate the results of same volatile on the different concentrations by Duncan’s multiple range test.*:P<0.05, different was significant;**:P<0.01, different was extremely significant

注:所得數(shù)據(jù)均經(jīng)χ2檢驗(yàn),**表示差異極顯著(P<0.01),*表示差異顯著(P<0.05),NS表示無(wú)選擇。下圖同
Note:The data obtained were all tested by χ2,**indicates that the difference was extremely significant (P<0.01),*indicates significant difference (P<0.05), and NS indicates no choice. The same picture below
圖1 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雄成蟲(chóng)對(duì)4種揮發(fā)物單品的嗅覺(jué)行為反應(yīng)
Fig.1 Behavior response ofMonoleptahieroglyphicaof male adults to the volatiles from four kinds

圖2 雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌成蟲(chóng)對(duì)4種揮發(fā)物單品的嗅覺(jué)行為反應(yīng)
Fig.2 Behavior response ofMonoleptahieroglyphicaof female adults to the volatiles from four kinds
植食性昆蟲(chóng)對(duì)一定濃度范圍內(nèi)的揮發(fā)性信息化合物的EAG反應(yīng)率與揮發(fā)物濃度成正比[30]。在4種揮發(fā)物中,雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雄成蟲(chóng)對(duì)α-紅沒(méi)藥醇和α-蒎烯的反應(yīng)值隨揮發(fā)物濃度的增加而增大,這與花絨寄甲、桃蛀螟雄蟲(chóng)的反應(yīng)規(guī)律較相似[31,32]。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲雌成蟲(chóng)對(duì)α-紅沒(méi)藥醇的反應(yīng)值隨揮發(fā)物濃度的增加而增大,這與光肩星天牛雌蟲(chóng)反應(yīng)規(guī)律較相似[33]。t檢驗(yàn)表明,雌雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲在一定濃度的揮發(fā)物刺激下具有明顯的EAG反應(yīng),且普遍高于雄蟲(chóng),部分顯著高于雄蟲(chóng),在一定濃度的同種揮發(fā)物刺激下,雌蟲(chóng)觸角的敏感性要高于雄蟲(chóng)。華山松大小蠹也存在這種類(lèi)似現(xiàn)象[34]。不同性別的昆蟲(chóng)個(gè)體對(duì)同種揮發(fā)物的氣味的反應(yīng)存在著一定差異[35,36],雌、雄雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)對(duì)同種濃度的α-紅沒(méi)藥醇和棕櫚酸刺激下反應(yīng)差異極顯著,對(duì)α-紅沒(méi)藥醇和α-石竹烯個(gè)別濃度差異顯著。松墨天牛雌、雄蟲(chóng)之間也存在這種相似現(xiàn)象[37]。雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)對(duì)α-紅沒(méi)藥醇、α-石竹烯和α-蒎烯具有較好的EAG反應(yīng)效果。這與張志虎[19]和劉航[28]的研究結(jié)果相似。說(shuō)明在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲寄主植物揮發(fā)物和成蟲(chóng)糞便中都含有誘集該害蟲(chóng)的信息化合物有效成分,促進(jìn)該蟲(chóng)產(chǎn)生聚集行為。
“Y”型嗅覺(jué)行為反應(yīng)中10 μL/mL的α-紅沒(méi)藥醇和α-蒎烯對(duì)雌、雄雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲的引誘效果明顯,α-紅沒(méi)藥醇為該葉甲寄主植物揮發(fā)物和成蟲(chóng)糞便揮發(fā)物中所共有,α-蒎烯對(duì)松墨天牛和華山松大小蠹也都具有明顯的引誘效果[32,34]。棕櫚酸和α-石竹烯的引誘效果不明顯,其中α-石竹烯對(duì)該蟲(chóng)有一定的趨避現(xiàn)象,但效果并不明顯。在嗅覺(jué)行為反應(yīng)中雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲對(duì)α-石竹烯的反應(yīng)并不明顯,這與EAG的測(cè)定結(jié)果有一定的差別,這說(shuō)明EAG反應(yīng)只能在一定程度上反映出昆蟲(chóng)對(duì)該化合物是否具有一定的敏感性,但并不能確定具有EAG反應(yīng)就同時(shí)具備嗅覺(jué)行為反應(yīng)[38]。需要結(jié)合電生理反應(yīng)和嗅覺(jué)行為反應(yīng)才能有效篩選出該蟲(chóng)糞便揮發(fā)物中對(duì)其具有引誘趨性的活性化合物。
在雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲成蟲(chóng)糞便中測(cè)得包括醇類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)等共29種揮發(fā)性化合物,其中以酯類(lèi)化合物的種類(lèi)和含量最多;通過(guò)該葉甲雌、雄成蟲(chóng)對(duì)選取的4種揮發(fā)性化合物的EAG反應(yīng),該葉甲雌、雄成蟲(chóng)均對(duì)α-石竹烯、α-蒎烯、α-紅沒(méi)藥醇反應(yīng)較明顯。并且雌、雄成蟲(chóng)對(duì)于相同濃度的同種揮發(fā)物的反應(yīng),雌蟲(chóng)的敏感性普遍更高。其雌、雄成蟲(chóng)均對(duì)10 μL/mL的α-紅沒(méi)藥醇EAG反應(yīng)效果最明顯,該葉甲雌、雄成蟲(chóng)對(duì)α-紅沒(méi)藥醇的敏感性較高。且雌、雄雙斑長(zhǎng)跗螢葉甲對(duì)α-紅沒(méi)藥醇的EAG反應(yīng)值隨揮發(fā)物濃度的增加而增大;該葉甲雌、雄成蟲(chóng)均對(duì)α-紅沒(méi)藥醇和α-蒎烯有較為明顯的趨性,對(duì)α-石竹烯和棕櫚酸無(wú)選擇性差異。α-紅沒(méi)藥醇和α-蒎烯可能為該葉甲成蟲(chóng)糞便中的有效活性成分。