豬流行性腹瀉病毒卵黃抗體的研制

潘建波

（廣西柳州市動物疫病預防控制中心 545001）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是引起豬流行性腹瀉的致病源，是一種高度接觸性、急性的傳染性疫病，可感染各日齡豬，主要臨床特征為嘔吐、腹瀉、發熱、食欲不振、精神沉郁等，仔豬的死亡率高達80%以上，給我國的養豬產業造成巨大經濟損失。鑒于該病的流行病學特點及對小豬危害的嚴重性，提升小豬的被動免疫能力，將是控制該病發生與流行的關鍵環節[1]。卵黃抗體在動物疫病預防與治療方面已得到廣泛的應用，具有成本低、易制備、使用方便的特點[2]。本研究用經鑒定保存的PEDV 強毒，制備成滅活疫苗免疫產蛋雞制備特異性卵黃抗體，旨在為更加有效地防控PEDV 提供技術支持和物質保障。

1 材料和方法

1.1 試驗用病毒

PEDV 由本實驗室分離并保存。

1.2 試驗用動物

約180 日齡產蛋雞。

1.3 PEDV 滅活苗的制備

1.3.1 水相制備

取發病后留存仔豬腸道組織，按1： 3 比例加入滅菌的磷酸鹽緩沖液繼續研磨，8000rpm 離心15min，取上清，加入抗生素后，再按0.4%福爾馬林混勻，于37℃滅活24h，每隔6h搖勻1 次，再加入4%吐溫-80，勻漿5min，即為水相，2～8℃保存。

1.3.2 油相制備

按96： 4 比例混合取10 號白油與司本，搖勻后再加入2%硬脂酸鋁，121℃高壓滅菌10min。

1.3.3 疫苗制備

以約3： 1 的比例混合油相與水相，攪勻油相5min，然后緩慢加入水相攪勻，加完后10000rpm 攪拌3min，靜置72h 不分層判為疫苗乳化合格。

1.4 特異性卵黃抗體的制備

1.4.1 疫苗免疫

取產蛋雞30 只，進行3 次免疫，首次免疫1ml/只，間隔10d 進行2 次加強免疫，免疫劑量為1.5ml/只，3 次免疫后7d，測卵黃抗體效價，抗體效價在1:32 以上開始收蛋。

1.4.2 抗體的制備

雞蛋清洗后用0.05%百毒殺浸泡5min 消毒，擦干后再用75%酒精擦拭消毒，在無菌條件下將蛋卵黃取出置于燒杯內，3000rpm 勻漿1min，加等體積的磷酸鹽緩沖液攪勻后，加入青霉素（終濃度200IU/ml） 和鏈霉素（終濃度200ug/ml），分裝于滅菌瓶中，置4℃保存。

1.5 動物治療試驗

在本市一確診發生豬流行性腹瀉的豬場內，對患病仔豬應用特異性卵黃抗體進行干預治療，口服3ml/次，每天3 次，對照組在進行抗生素治療。

2 結果

2.1 卵黃抗體效價測定

取3 免疫后7d 的雞蛋，以保存組織毒的上清為瓊擴抗原，卵黃進行倍比稀釋，36h 后在1:32 處可見瓊擴沉淀線（見附圖）。

2.2 動物治療試驗結果

對出生3d 后發病的仔豬各10 頭進行干預治療，結果表明，特異性卵黃抗體組效果明顯，治愈率60%，抗生素組僅為20%，未治療組全部死亡（見附表）。

3 討論

PED 對仔豬而言屬于發病急、死亡率高的疾病，3 日齡內感染發病的仔豬若不進行干預治療，死亡率可達100%。7 日齡以上的仔豬對該病有一定的抵抗力，但會成為病毒的傳染源。對于7 日齡內的仔豬，靠自身的主動免疫來抵抗感染PEDV 是不科學的，因為疫苗產生堅強的免疫應答一般需要一周的時間，同時，因為仔豬的免疫系統還沒有完全成熟，在較短時間內通過疫苗免疫的方式刺激機體產生有效抗體是更大的挑戰[3]。因此，被動免疫是保護仔豬免受病毒感染的最理想的方式。高免血清或康復血清對仔豬進行被動免疫效果雖好，但制備過程煩瑣、產量低、成本高、不適于產業化生產。蛋雞作為卵黃抗體的主要提供者，易于規模化飼養，且產蛋量高，適合于工業化生產，同時降低了因使用同源物質而造成疫病傳染的危險。臨床治療效果表明，本研究制備的特異性卵黃抗體對治療PEDV 有明顯的效果，為有效防控PED 的流行與發生奠定了物質基礎。

附表 特異性卵黃抗體治療PEDV 感染試驗