基于網絡藥理學研究絡石藤-伸筋草藥對治療骨關節炎的作用機制

蔣濤 孔博 顏威 吳昌桂 徐醒 江敏 奚小冰

摘要 目的：運用網絡藥理學方法研究絡石藤-伸筋草藥對治療骨關節炎的生物活性成分和潛在的作用機制。方法：從中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）和中國科學院化學專業數據庫（CASC）中收集已知的絡石藤-伸筋草藥對中的生物活性化學成分;使用Swiss Target Prediction網絡服務器預測化合物的蛋白靶點;從疾病數據庫中挖掘已知的骨關節炎相關靶點數據;利用收集到的數據分別構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡并提取其交集作為藥物-疾病相互作用網絡，通過網絡拓撲學分析篩選出核心靶點;使用DAVID數據庫對核心靶點進行GO注釋分析和KEGG通路分析。結果：從TCMSP和CASC數據庫中共收集到108個已知的絡石藤-伸筋草藥對中的化學成分，虛擬篩選后得到17個生物活性化合物，并預測出117個潛在的蛋白靶點;從疾病數據庫中一共檢索到191個骨關節炎相關靶點;對化合物和疾病的交集PPI網絡進行網絡拓撲學分析得到208個核心靶點，這些靶點主要富集到自噬、凋亡、炎性反應、雌激素相關的生物過程和信號通路。結論：絡石藤-伸筋草藥對可能通過多條生物途徑發揮調節炎性反應、自噬、凋亡和類雌激素樣作用發揮抗骨關節炎作用。

關鍵詞 網絡藥理學;絡石藤;伸筋草;藥對;骨關節炎

Potential Mechanism of Herb Pair Caulis Trachelospermi and Herba Lycopodii on Osteoarthritis Based on the Network Pharmacology Study

JIANG Tao1，2，Kong Bo1，2，YAN Wei1，2，WU Changgui1，2，XU Xing2，JIANG Ming2，XI Xiaobing 1，2

（1 Shanghai Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 20025，China; 2 Shanghai Key Laboratory of Prevention and Cure of Bone and Joint Disease by Combined Chinese and Western Medicine，Shanghai 20025，China）

Abstract Objective：To excavate the bio-active compounds and potential molecular mechanism for the herb pair Caulis Trachelospermi and Herba Lycopodii on osteoarthritis （OA） based on the network pharmacology method.Methods：Known bioactive-ingredients of the of herb pair were obtained from the Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） and the Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS，Chemistry Database （CASC） with their potential targets predicted by the Swiss Target Prediction server.Known OA-related genes were mined in disease databases; protein-protein interaction （PPI） network was constructed with the collected data，and their intersection was extracted as drug-disease interaction network; core gene targets were screened through network topology analysis.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes signaling pathway analysis and Gene ontology analysis were performed to reveal gene function by DAVID database.Results：A total of 108 ingredients of two herbs were retrieved from the TCMSP and CASC databases and 17 of them are considered to be bio-active which yield 117 possible targets.191 OA-related targets were retrieved from the disease database.Network topology analysis of the Drug-disease interaction network yielded 208 core targets，which mainly enriched into inflammation，autophagy，and estrogen-related biological processes and pathways.Conclusion：The Caulis Trachelospermi-Herba Lycopodii herb pair may treat OA through adjusting inflammatory，autophagy and exerting estrogen-like effect，which embodied the multi-component，multi-target and multi-pathway synergy characteristics of traditional Chinese medicine，and provided ideas for further research.

Keywords Network pharmacology; Caulis Trachelospermi; Herba Lycopodii; Herb pair; Osteoarthritis

中圖分類號：R285;R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.24.003

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是一種以關節軟骨退化和滑膜炎為特征的骨與關節退行性疾病，臨床表現為關節僵硬、腫脹、疼痛、活動受限等[1]。OA在老年人群中發病率較高，嚴重者可能導致身體殘疾，嚴重影響患者的生命質量[2]。目前OA的藥物療法主要包括口服阿片類鎮痛藥或非甾體抗炎藥、關節腔內注射皮質類固醇等，這些藥物通常伴隨胃腸道刺激反應，長期使用可能會影響肝腎功能，增加心血管事件的風險，因此許多患者不愿使用[3]。

OA屬于中醫“痹癥”的范疇。絡石藤-伸筋草藥對是著名中醫骨傷流派魏氏傷科治療風濕痹痛常用的配伍組合，其具有祛風除濕、通痹止痛的作用，在臨床治療OA、慢性腰背痛中有廣泛的運用。絡石藤是夾竹桃科植物絡石（Trachelospermum jasminoides（Lindl.）Lem.）的干燥帶葉藤莖，《本草綱目》中記載：“絡石，氣味平和，其功主筋骨關節風熱癰腫，變白耐老”。現代藥理學研究表明，絡石藤甲醇提取物在體外通過抑制環氧合酶-1，環氧合酶-2，磷脂酶A2和12-脂氧合酶發揮抗炎功效[4]。伸筋草是石松科植物石松（Lycopodium japonicum Thunb.）的干燥全草，《本草拾遺》中記載：“（伸筋草）主人久患風痹，腳膝疼冷，皮膚不仁，氣力衰弱”。伸筋草提取物主要發揮鎮痛、抗炎、抗氧化的作用[5]。

本研究旨在通過網絡藥理學方法探索絡石藤-伸筋草藥對中治療骨關機炎的生物活性成分及其藥理學機制，為后續的研究提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥化學成分虛擬篩選

通過檢索“中藥系統藥理數據庫和分析平臺”（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中國科學院上海有機化學研究所化學專業數據庫（CASC.http：//www.organchem.csdb.cn.）獲取伸筋草和絡石藤的已知化學成分及其藥代動力學參數。進而篩選出具有生物活性的化合物納入研究，篩選標準為化合物口服吸收利用度大于20%（OB>20%），化合物類藥性大于0.18（DL>0.18）?？诜绽枚缺硎窘涍^口服將特定化合物遞送至體循環的能力。類藥性指的是一個理想藥物應基本具備的特性，是化合物的理化性質以及結構特征的綜合反映。

1.1.2 檢索OA相關靶點數據

OA相關靶點數據收集自Drugbank數據庫（https：//www.drugbank.ca），Therapeutic Target Database數據庫（TTD，http：//systemsdock.unit.osit.jp/iddp/home/index），以及DisGeNET數據庫（http：//www.disgenet.org/）。檢索詞設定為“osteoarthritis”，種屬限定為“homo sapiens”。

1.2 方法

1.2.1 生物活性化合物的靶點預測

從Pubchem數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）中獲取絡生物活性化合物的標準結構。根據結構相似性原則，使用SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）網絡服務器預測可能與生物活性成分相互作用的人類蛋白靶點。

1.2.2 成分靶點網絡的構建

利用Cytoscape軟件構建一個成分-靶點相互作用網絡。網絡中的節點代表特定的成分或蛋白靶點，網絡中的邊代表成分與靶點之間的相互作用。節點的度值（Degree）表示與該節點相連的邊的數量，度值越大，說明該節點在網絡中更加具有“中心性”。

1.2.3 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建及網絡拓撲學分析

為了系統地研究化合物與靶點之間復雜的協同作用，利用上述得到的生物活性成分相關靶點數據和已知的OA相關靶點數據分別構建2個蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡。網絡中的節點代表特定的蛋白靶點，網絡中的邊表示相鄰蛋白之間的相互作用。提取2個PPI網絡的交集部分構成一個新的交集網絡。對交集網絡進行網絡拓撲學分析，挖掘其核心節點。本研究選用“中介中心性”（Betweenness Centrality，BC），“接近中心性”（Closeness Centrality，CC），“度中心性”（Degree Centrality，DC），“特征向量中心性”（Eigenvector Centrality，EC），“網絡中心性”（Network Centrality，NC），“局部平均連通性”（Local average Connectivity，LAC）共6個網絡拓撲學參數。首先篩選出DC值大于兩倍中位數的節點構成顯著交集PPI網絡，在此基礎上進一步篩選出同時滿足BC，CC，DC，EC，NC，LAC分別大于中位數的網絡節點構成核心PPI網絡。

1.2.4 富集分析

本研究使用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行Gene Ontology（GO）注釋分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析。GO注釋分析主要包括生物過程（Biological Process），分子功能（Molecular Function）和細胞組成（Cellular Component）3個部分，本研究中我們主要關注生物過程部分。種屬限定為“homo sapiens”，P<0.05。

2 結果

2.1 絡石藤-伸筋草藥對中的生物活性成分及其作用靶點

在TCMSP和CASC數據庫中檢索“絡石藤”和“伸筋草”2個詞條，共收集到108個已知的小分子化合物，其中包括34個絡石藤化合物，72個伸筋草化合物和2個伸筋草-絡石藤共有的化合物。只有17個小分子化合物滿足OB>20%，DL>0.18的篩選條件（表1），包括4個來自伸筋草的化合物，11個來自絡石藤的化合物以及2個伸筋草-絡石藤共有的化合物。這17個小分子化合物被認為是絡石藤-伸筋草藥對發揮藥理作用的主要生物活性化合物。使用SwissTargetPrediction網絡平臺預測可能與這17個生物活性小分子化合物相互作用的蛋白靶點，去除重復值之后，共收集到117個靶點。選取可與2個以上化合物相互作用的蛋白靶點構建一個“成分-靶點相互作用網絡”來揭示生物活性化合物與其靶點的復雜相互作用關系，該網絡有77個節點和186條邊。大多數小分子化合物能夠作用于多個蛋白靶點，大多數蛋白靶點對應一個以上的化合物。其中，酪氨酰DNA磷酸二酯酶1（TDP1），微管相關tau蛋（MAPT），雌激素受體1（ESR1），溶質載體家族6成員2（SLC6A2），腺苷A1受體（ADORA1）的度值大于5（Degree>5），說明分別有5個以上的小分子化合物可以作用于這些靶點。見圖1。

2.2 已知的OA相關靶點

以“osteoarthritis”為關鍵詞檢索Drugbank，TTD，DisGeNET數據庫，分別獲得83、20、103個已知的OA治療靶點。去除重復值后，一共獲得191個OA相關靶點，其中有19個靶點與生物活性化合物的靶點重合（圖2A）。這表明絡石藤和伸筋草配伍使用既能夠增加治療靶點數量，擴大治療范圍，又能協同作用于共同靶點，提高療效。從圖2B中可以看到，木犀草素（Luteolin）、芹菜素（Apigenin）和去甲漢黃芩素苷（Norwogonin）分別能與8個、5個、5個關鍵靶點發生相互作用，是絡石藤中最主要的抗骨關炎成分;6-O-E-阿魏酰筋骨草苷（6-O-E-Feruloylajugol）能作用于6個關鍵靶點，是伸筋草中的最主要的抗OA成分。

2.3 PPI網絡的構建與核心節點篩選

生物活性化合物靶點PPI網絡（圖3A）有4 121個節點和105 753條邊，OA相關靶點PPI網絡（圖3B）一共有4 553個節點和106 014條邊。通過提取2個PPI網絡的重疊部分構建交集網絡，獲得生物活性化合物-OA相互作用的PPI網絡（圖3C），該網絡有2 497個節點和70 933條邊?；谥暗难芯縖8]，篩選出DC值大于兩倍中位數（DC>74）的節點作為顯著節點，并構建顯著交集PPI網絡（圖3D），該網絡具有591個節點和25 557條邊。再此基礎上篩選出同時滿足BC、CC、DC、EC、NC、LAC分別大于中位數的節點作為核心節點，并構建核心PPI網絡（圖3E）。本研究中，BC、CC、DC、EC、NC、LAC的中位數分別為366.534、0.532、76、0.031、22.448、24.431。核心網絡一共有208個節點和7 352條邊。

2.4 富集分析

利用DAVID數據庫對上述208個核心靶點進行富集分析。其中GO注釋分析（圖4A）主要得到調節自噬（GO：10 506，P=3.32E-03）、凋亡過程（GO：6 915，P=4.57E-03）、MAPK級聯（GO：165，P=2.31E-05）、I-κB激酶/核因子-κB信號傳導（GO：7 249，P=8.54E-04）、NIK/核因子-κB信號傳導（GO：38 061，P=1.32E-03）等細胞炎性反應、自噬相關的生物過程。KEGG通路富集分析（圖4B）主要得到MAPK信號通路（KEGG04010，P=2.04E-05）、HIF-1信號通路（KEGG04066，P=2.85E-05）、PI3K-Akt信號通路（KEGG04151，P=5.65E-05）、FoxO信號通路（KEGG04068，P=2.11E-03）、核因子-κB信號通路（KEGG04064，P=6.46E-03）、Notch信號通路（KEGG04330，P=7.11E-03）、TGF-β信號通路（KEGG04350，P=1.97E-02）等炎性反應、自噬相關信號通路，以及雌激素信號通路（KEGG04915，P=1.10E-06）、GnRH信號通路（KEGG04912，P=8.23E-03）等雌激素相關信號通路。

3 討論

中醫藥治療疾病具有多成分、多靶點、多途徑協同作用的特點，是其區別于西藥的一大特征[6]。但也由于其多種成分混雜，作用機制不明確等原因受到許多質疑。傳統藥理學研究方法由于其主要著眼于單個靶點和通路，不能體現中醫藥的特色，也不符合于中藥現代化研究的要求。在國家積極推動中藥現代化研究的大背景下，如何在繼承和發揚中醫藥優勢和特色的基礎上，充分利用好現代科學技術的理論和方法對中藥進行深入的研究與開發是當下的難點。網絡藥理學是一種新興的藥物研發手段。2007年，清華大學李梢教授首先提出基于生物網絡的中藥方劑研究框架[7]。同年，英國的Hopkins教授提出“網絡藥理學”（Network Pharmacology）一詞，并將其定義為“下一代藥物研發模式”[8]。近年來，網絡藥理學用于中醫藥現代化研究已經取得了豐富的成果，吸引了多學科研究者的關注。

本研究對絡石藤-伸筋草藥對中的化合物進行虛擬篩選發現有17種口服吸收利用度高（OB>20%），類藥性好（DL>0.18）的小分子化合物能夠進入生物體體循環中發揮作用。值得注意的是，雖然相比于絡石藤，伸筋草中已經被鑒別出更多的化合物，但是伸筋草中的化合物普遍具有較低的口服吸收利用度，這使得這些化合物比較難進入體循環發揮作用。木犀草素、去甲漢黃芩素苷、芹菜素和6-O-E-阿魏酰筋骨草苷分別能夠作用于5個以上抗OA關鍵靶點，被認為是藥對中主要發揮抗OA作用的成分。木犀草素在體外和體內實驗中均表現出較好的抗炎活性，其主要通過核因子-κB，MAPK通路發揮作用[9]。Khan等[10]的研究發現漢黃芩苷可以通過ROS/ERK/Nrf2信號通路發揮抗炎和軟骨保護作用。芹菜素是一種有效的樹突狀細胞成熟和遷移抑制劑，在膠原誘導的關節炎模型中可以有效地預防關節炎[11]。其他研究表明芹菜素通過包括核因子-κB，MAPK和蛋白激酶B等多種的信號通路發揮抗炎作用[12-13]。

MAPT靶點可能與絡石藤-伸筋草藥對中的7種生物活性成分相互作用。MAPT是經典炎性通路MAPK信號通路中的重要節點，Feng等[14]的研究發現細胞內MAPT蛋白水平升高可導致細胞自噬障礙。此外，許多植物類黃酮已被發現可以通過發揮類雌激素樣作用改善去卵巢小鼠的骨密度[15]。OA在雌激素水平低于正常值的絕經后老年婦女人群中最為常見，這說明雌激素可能是OA重要的調節因子。來自絡石藤和伸筋草的芹菜素、去甲漢黃芩苷、芒柄花黃素、谷甾醇和豆甾醇等都可能作用于ESR1靶點，這表明這些化合物可能具有類雌激素活性。

OA的特征性病理表現是關節軟骨的退變，其分子機制主要與軟骨細胞的自噬和凋亡有關[16]。自噬可以清除細胞受損的細胞器和失效大分子，是維持細胞內穩態的不可或缺的機制。核心交集PPI網絡節點的GO注釋分析結果發現，絡石藤-伸筋草藥對可能可以在調節自噬、凋亡過程等生物過程中發揮作用。此外，KEGG通路分析也發現了該藥對可以作用于HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等調節自噬的關鍵通路。HIF-1信號通路與細胞適應缺氧環境有關，關節軟骨中沒有血管、神經和淋巴組織，其主要通過滑膜液和軟骨下骨擴散至軟骨層的氧氣和營養來維持軟骨細胞的活力，因此關節軟骨長期處于一個低氧的狀態[17]。HIF-1信號通路在缺氧誘導關節軟骨的自噬和凋亡中發揮作用[18]。Zhang等[19]在膝關節炎大鼠模型中發現HIF-1a的表達增高，通過抑制HIF-1a可以改善大鼠滑膜纖維化。Xue等[20]的研究發現，抑制OA大鼠軟骨細胞的PI3K-Akt信號通路能夠促進關節軟骨細胞的自噬，減輕炎性反應。

抗炎療法是目前臨床治療OA的重要手段[21]。交集PPI網絡核心節點的KEGG通路富集分析結果顯示，絡石藤-伸筋草藥對可能通過調節多條通路發揮調節炎性反應的作用，其中主要包括核因子-κB信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、Notch信號通路、TGF-β信號通路等。GO注釋分析也發現該藥對能調節MAPK級聯和核因子-κB信號傳導等炎性反應相關生物過程。MAPK信號通路和核因子-κB信號通路是經典的炎性反應通路，許多現有的藥物主要通過這2個通路發揮抗OA作用[22-23]。成分-靶點網絡中可見絡石藤-伸筋草藥對中的多個化合物可能可以直接作用于MMP1，MMP2，MMP3，MMP9，MMP13等多個基質金屬蛋白酶家族的靶點，這些靶點是MAPK信號通路中的核心節點。此外，FoxO信號通路與細胞應對氧化應激有關，關節軟骨細胞中的FoxO的表達會隨衰老和關節炎而減少[24]。體內研究表明，OA軟骨細胞中FoxO的表達增加能夠有效減少炎性反應遞質和軟骨降解酶的產生，增加保護性基因的表達，并發揮拮抗白細胞介素-1β的作用[25]。TGF-β減少miR140在人體內的活性，miR140是一種miRNA，它能夠下調例如MMP13、ADAMTS5等損害關節軟骨的基因的表達。全身性抑制TGF-β被認為是抑制OA病理進程的選擇之一，但這也將導致健康軟骨中TGF-β活性受到抑制，從而損害正常的軟骨[26]。

本研究通過網絡藥理學方法系統地揭示出絡石藤-伸筋草藥對可能通過多條生物途徑發揮調節炎性反應、自噬、凋亡和類雌激素樣作用發揮抗OA作用。這一結果符合中醫藥治療疾病的多成分、多靶點、多通路協同作用的特點，同時也說明網絡藥理學方法運用于中醫藥研究的科學性和有效性。

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（2020-02-25收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81703576）;上海市中醫藥三年行動計劃項目[ZY-（2018-2020）-CCCX-1011]作者簡介：蔣濤（1994.01—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫骨傷科研究，E-mail：jt10210@163.com通信作者：奚小冰（1971.07—），男，碩士，主任醫師，研究方向：中醫骨傷科研究，E-mail：skxixiaobing@163.com