擬穴青蟹一種含CTLD結構域基因的克隆及表達分析

王 田，趙 明，張鳳英，馬凌波，馬春艷

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業農村部遠洋與極地漁業創新重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）隸屬于甲殼綱（Crustacea），梭子蟹科（Portunidae），青蟹屬，是我國重要的海水養殖蟹類，主要分布在東南沿海［1］。隨著養殖規模的擴大，養殖水域的水質逐漸惡化，導致病害頻發，嚴重制約了產業發展。提高擬穴青蟹自身免疫力能減少抗生素的使用，對于蟹苗成活率的提高及良性養殖模式的建立具有重要意義。擬穴青蟹的血液循環方式為開管式循環，因而缺乏抗體介導的免疫反應，僅具有先天性免疫［2-3］。模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）能夠與病原相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）結合，二者的相互識別和作用是啟動先天免疫應答的關鍵。C型凝集素（C-type lectin，CLEC）是鈣離子依賴型的一類動物凝集素［4］，是擬穴青蟹重要的模式識別受體［4-5］，種類繁多，功能多樣，是免疫研究的一大熱點。

C型凝集素的典型特點是具有一個或多個糖識別結構域（carbohydrate recognition domain，CRD），CRD必須與鈣離子結合才能發揮凝集活性［4］。研究證實C型凝集素家族中的一些蛋白已失去凝集活性，因而將CRD改為CTLD（C-type lectin-like domain）更為準確。CTLD是C型凝集素家族的功能保守區，含有110～130個氨基酸殘基，其整體為內外雙環結構，內環也叫長環區（long loop region，LLR），長環區參與了鈣離子依賴的糖結合活性，能夠識別PAMP，從而激發先天免疫反應。根據有無長環區將CTLD分為常規型和緊密型兩種類型。除此之外，CTLD含有4個保守的半胱氨酸，可形成兩對二硫鍵，以此來穩定自身結構。與脊椎動物C型凝集素的保守性相比［6］，無脊椎動物含有種類更為豐富、功能更加多樣的 C型凝集素，例如，在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的基因組中檢測到32個編碼 CTLD的基因，在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發現了至少183個 C型凝集素基因［7］，這表明無脊椎動物的C型凝集素極有可能具有不同的配體特異性。目前對于擬穴青蟹C型凝集素的研究有了較為豐富的成果，例如已證明C型凝集素表達于多種重要的免疫組織［8-9］，如肝胰腺、血淋巴、鰓等。且同一組織可產生多種不同功能的C型凝集素［8-9］。這些凝集素參與前酚氧化酶活化［10］、包膜增強［10］、血細胞結瘤、抗菌活性［11］、抗真菌活性［12］等，例如，來自煙草天蛾（Manduca sexta）幼蟲的C型凝集素可刺激酚氧化酶活化或促進細胞包囊和黑化［13］。由于C型凝集素種類及功能多樣，擬穴青蟹中C型凝集素的分子特征和功能還有很大的研究空間。

本文在擬穴青蟹中發現了一種含CTLD結構域的新基因，將其命名為SpCTLD，通過生物信息學方法對其cDNA全長進行分析，通過qPCR技術檢測該基因在擬穴青蟹幼體不同發育時期和組織中的表達，通過人工感染副溶血弧菌來初步研究SpCTLD在擬穴青蟹抗細菌反應中是否發揮作用，旨在豐富擬穴青蟹C型凝集素的研究，對其先天免疫機制的研究起到參考作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

擬穴青蟹幼體樣本取自海南瓊海東海水產研究所養殖基地，根據擬穴青蟹不同發育時期的特點，可將其幼體時期分為溞狀幼體 I-V（Z1-Z5）、大眼幼體（M）、仔蟹 I期（C1）和仔蟹Ⅱ期（C2）。未處理的成蟹樣本購于上海市東方水產市場。副溶血弧菌脅迫實驗所用成蟹樣本網購于潮汕，經形態及分子鑒定，確定為擬穴青蟹。實驗前將擬穴青蟹在本實驗室水循環系統中提前養殖一周。所取樣品均加無液氮型樣品RNA保存液（生工生物工程有限公司），凍至-80℃保存，以備后續提取RNA使用。

1.2 實驗方法

1.2.1SpCTLD全長的獲得

本實驗室通過轉錄組測序獲得了SpCTLD的核心序列，在此基礎上利用 NCBI在線軟件（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／tools／primerblast／）設計特異性引物，5′-RACE的特異性引物為 5-F1：TTGCTTTCTCTGACCCTTAT，3′-RACE的特 異 性 引 物 為 3-R1：TCTAAGCCAACGAATGCAGC，另一方向引物為試劑盒自帶通用引物。將RACE產物電泳檢測，并割膠回收目的條帶，克隆到 pMD19-T載體上，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，挑取陽性克隆送至上海杰李生物公司測序，通過對所得序列進行拼接，并與本實驗室數據庫進行本地Blast，最終獲得1 237 bp的 cDNA序列（Genebank：MN508365）。3′-RACE結果見圖1。

圖1 3′-RACE擴增結果Fig.1 Amplification result of 3′-RACE

1.2.2 序列的生物信息學分析

使用 NCBI在線比對工具 BLAST（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）進行比對分析。使用 ORF Finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）查找序列的開放閱讀框。使用 InterPro（http：／／www.ebi.ac.uk／interpro／）分析蛋白質的同源家族、保守結構域、信號肽等。使 用 ExPASy （https：／／web. expasy. org／protparam／）分析蛋白質的分子量和等電點。使用 Target P 1.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）預測亞細胞定位，使用 Mitoprot（http：／／ihg.gsf.de／ihg／mitoprot.html）預測線粒體定位序列。

1.2.3 病原脅迫實驗的樣品處理

實驗所用擬穴青蟹平均體質量在80 g左右，設置4組樣本，分別為空白對照組、生理鹽水組、滅活的副溶血弧菌組、有活性的副溶血弧菌組。前期預實驗證明1×105CFU·mL-1是擬穴青蟹產生免疫響應的最佳劑量。將培養的副溶血弧菌稀釋為1×105CFU·mL-1，取二分之一體積進行高溫高壓滅活。空白對照組不注射任何藥品，其他3組分別注射生理鹽水、滅活的副溶血弧菌、有活性的副溶血弧菌，每只擬穴青蟹注射量為 25μL。空白對照組取樣時間為 0、3、6、9、12、24 h，其他 3組取樣時間點為 3、6、9、12、24 h，每組每個取樣時間點設置3個重復（3只蟹），所取組織為血淋巴（HE）、肝胰腺（HEP）、胸神經節（TG）、肌肉（MU）、鰓（GI）、心臟（H）、大觸角（ATA）、小觸角（ATU）、Y器（YO）、表皮（CU）、眼柄（ET），組織樣品加無液氮型樣品RNA保存液（生工生物工程有限公司），凍至-80℃保存，后續提取RNA并反轉錄。

1.2.4 實時熒光定量 PCR分析

由于18S rRNA在擬穴青蟹的多種樣本中穩定表達，本文將其作為SpCTLD基因表達分析的內 參 基 因［14］，18S 引 物 序 列 為 18S-F：GGGGTTTGCAATTGTCTCCC，18S-R：GGTGTGTA CAAAGGGCAGGG。每個樣本3個重復，采用標準曲線法分析SpCTLD在各個樣本中的相對表達量，并對其進行生物學顯著性差異分析。qPCR所用引物為 C-F：TCTGACCCTTATCGCGGCTA，CR：AAAAAGGAGGTCAGCCCCTC。所用試劑盒為北京全式金生物技術有限公司的Tip Green qPCR SuperMix試劑盒，反應體系為10μL，包含正向引物0.2μL，反向引物0.2μL，SuperMix 5μL，無核酸酶水3.6μL，cDNA模板1μL，兩步法程序設為94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。

2 結果與分析

2.1 SpCTLD基因的cDNA序列分析

通過序列擴增，獲得的SpCTLD基因cDNA全長為1 237 bp，其中開放閱讀框為468 bp，編碼155個氨基酸，此外還有82 bp的5′UTR和687 bp的3′UTR，在3′UTR區域含有典型的加尾信號AATAAA（圖 2）。預測其蛋白分子量為18.32 kDa，等電點為 7.56。Target P 1.1 Server和Mitoprot預測該蛋白定位于線粒體，含有信號肽，為分泌蛋白，該預測可靠性等級為1（最高等級可信度）。線粒體靶向序列為第1到14個氨基酸（MAPSRPLVLLTVLL），切割位點為第15個氨基酸（S）。信號肽預測結果為第1到21個氨基酸，信號肽N端為第1到6個氨基酸，疏水核心區為第7到16個氨基酸，C端為第17到21個氨基酸。配體結合位點為124E、128A、130N、136K、138S、139S、140E、141Y、144D、145Y、146K。結構域CTLD位于第26到151個氨基酸。在第89到91個氨基酸出現了Ca2+特征性識別基序LND。

2.2 SpCTLD基因在擬穴青蟹幼體和組織中的表達

從溞狀幼體I期到仔蟹Ⅱ期，SpCTLD在擬穴青蟹幼體各個時期均有表達（圖3），并且整體表達量較高。從Z1期到Z4期整體表達量較為穩定，至Z5期達到最高點，而后至M期和C1期略有下降，C2期表達量大幅下降，遠遠低于其他時期，達到最低點。

qPCR檢測SpCTLD在擬穴青蟹不同組織中的表達結果顯示，SpCTLD在所檢測的12個組織（血淋巴HE、肝胰腺HEP、眼柄ET、射精管ETU、精巢 TE、肌肉 MU、鰓GI、心臟 H、大觸角ATA、小觸角ATU、Y器 YO、表皮 CU）中均有表達（圖4），其中在鰓中表達量最高，射精管次之，且兩者的mRNA表達量遠遠高于其他組織。SpCTLD在肝胰腺、表皮、大觸角、小觸角、血淋巴、肌肉這幾個組織中的表達量比較接近，遠低于其在鰓和射精管的表達量。其中心臟、Y器、眼柄以及精巢的mRNA呈現顯著低表達，且這幾者的表達量較為接近。

2.3 病原脅迫樣本中SpCTLD基因的表達分析

副溶血弧菌感染擬穴青蟹后，選取肝胰腺、血淋巴、鰓3個重要的免疫組織進行SpCTLD表達模式分析，SpCTLD的mRNA在組織中的相對表達量變化分別對應圖5、圖6、圖7。綜合來看，3個組織中的空白對照組和生理鹽水組表達較為平穩，整體變化不大。在肝胰腺中，活菌組中SpCTLD的表達在9 h明顯升高，到12 h達到最高。滅活菌組和活菌組的表達模式基本一致，但滅活菌組的表達量明顯低于活菌組。在血淋巴中，滅活菌組在9 h表達量達到最高，活菌組在12 h達到最高。在鰓中，滅活菌組的mRAN表達量變化不顯著，活菌組的表達量在12 h達到最高。

圖2 SpCTLD的cDNA全長及編碼的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and coding am ino acids of SpCTLD

圖3 SpCTLD基因在幼體不同發育時期的表達Fig.3 Expression of SpCTLD during different larval development stages

圖4 SpCTLD在不同組織中的表達Fig.4 Tissue distribution analysis of SpCTLD

圖5 不同處理組樣本肝胰腺中SpCTLD的表達變化Fig.5 Expression of SpCTLD in hepatopancreas sam ples from different treatment groups

圖7 不同處理組樣本鰓中SpCTLD的表達變化Fig.7 Exp ression of SpCTLD in gill sam p les from different treatment groups

3 討論

本研究獲得了擬穴青蟹一種C型凝集素新基因SpCTLD的cDNA全長，生物信息分析顯示，SpCTLD具有C型凝集素家族的保守結構域CTLD（26-151aa），此結構主要由兩個α螺旋和兩個反向的β折疊組成［15］，其雙環結構中的長環區參與了鈣離子依賴的糖結合活性，能夠通過識別PAMP從而激發先天免疫反應。CTLD超家族內部存在廣泛的結構差異，具有除糖結合外的一系列其他功能。CTLD含有的Ca2+特征性識別基序有 EPN，N-乙酰氨基葡萄糖胺（GlcNAc），巖藻糖（Fuc）和葡萄糖（Glc），QPD（Gln-Pro-Asp）等，能夠識別半乳糖（Gal）和 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）［16］。其中EPN基序對甘露糖的結合起重要作用，QPD基序對半乳糖的結合起重要作用。所有的脊椎動物都有一個WND基序。但在無脊椎動物中，進化導致了CTLD缺乏特征性基序WND，或者突變為其他類似基序。例如在LvLT［17］和 PsLT［11］中，WND基序被 VND取代。同樣，MnCTLDcp1中的 WND被 WTD替代［18］。有研究表明，許多蝦的QPD基序發生了突變。昆蟲和蝦的 C型凝集素或含有 FRD，或含有VND［19］，但這并不影響它們的細菌凝集活性或特異性［20］。本研究獲得的擬穴青蟹SpCTLD氨基酸序列中未發現WND基序，而是存在LND基序，而LND是Ca2+特征性識別基序之一，因此符合無脊椎動物CTLD的進化特征。

一般來說，基因功能和其表達分布存在密切關系。SpCTLD在擬穴青蟹幼體不同時期都有表達且整體表達量較高，在溞狀幼體Ⅴ期表達量最高，推測與溞狀幼體Ⅴ期向大眼幼體變態有關，因為變態過程中青蟹抵抗力弱，易受病菌感染。仔蟹Ⅱ期表達量最低，可能是由于隨著青蟹的發育，其生理機能趨于完善，適應能力與生存能力大幅提升。對SpCTLD的組織分布分析表明，在所檢測的12個組織中均有表達，即SpCTLD傾向于廣泛分布，這與先前的一些研究結果一致——在除了肝胰腺的其他組織中高表達的C型凝集素傾向于廣泛分布［15］。甲殼動物的鰓是一種非常重要的器官，具有呼吸、排泄、滲透壓調節、病害防御等功能［21］。本研究中SpCTLD在鰓中的表達量遠高于其他組織，符合鰓的生物學功能特征。另外，SpCTLD在射精管中的顯著高表達值得注意，提示該基因可能與青蟹的生殖相關。這與先前的研究有相似之處，段利朋等［22］從擬穴青蟹肝胰腺中克隆得到兩條C型凝集素基因：Splectin3和Sp-lectin4，二者于射精管中高表達，證明其在生殖系統中發揮重要作用，因此SpCTLD在擬穴青蟹生殖系統中的具體功能需要深入研究。副溶血弧菌脅迫實驗中，活菌組都在12 h達到最高，在24 h迅速下降，滅活菌組在9 h或12 h達到最高，樣本處理后12 h內活菌組SpCTLD的mRNA表達量上調最為顯著，說明SpCTLD可能參與了擬穴青蟹的抗副溶血弧菌反應，但對于闡明SpCTLD的具體作用機制及功能，后期還需深入研究。

綜上，本研究獲得了擬穴青蟹C型凝集素家族新基因SpCTLD的cDNA全長，通過副溶血弧菌脅迫實驗初步證明了其參與擬穴青蟹抗細菌反應，在擬穴青蟹先天免疫過程中發揮作用，該研究結果對豐富C型凝集素在甲殼動物先天免疫反應中的研究有積極意義。