大口黑鱸北方亞種群體和“優鱸1號”群體及其正反雜交子代的遺傳和生長性能比較

周家輝，李勝杰，姜 鵬，孫 雪，韓林強，白俊杰

（1.中國水產科學研究院珠江水產研究所，農業農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣州 510380；2.上海海洋大學，上海 201306；3.佛山市三水白金水產種苗有限公司，廣東佛山 528133）

大口黑鱸（Micropterus salmoides），隸屬于鱸形目（Perciformes），太陽魚科（Cehtrachidae），黑鱸屬，是一種著名的游釣性魚類，根據形態和地理分布差異大口黑鱸可分為北方亞種（M.salmoides salmoides）和佛羅里達亞種（M.salmoides floridanus）［1］。大口黑鱸具有生長快、抗病力強、起捕率高、無肌間刺、肉質鮮美等諸多優點［2］，深受養殖者和消費者喜愛，現已推廣到全國各地養殖。2017年大口黑鱸國內年產量為45.7萬 t［3］，是我國的主導養殖魚類之一。樊佳佳等［4］和李勝杰等［5］通過形態學特征和分子標記的研究表明，我國養殖的大口黑鱸在分類地位上屬于北方亞種。基于群體選育，中國水產科學研究院珠江水產研究所培育的大口黑鱸“優鱸1號”（GS01-004-2010）新品種生產性能優良，其推廣應用在一定程度上滿足了養殖業的需求，但目前苗種市場對良種的需求仍然較大［6-7］。

大口黑鱸自1983年從中國臺灣引進到內地后，未再引進新的種質資源。經過多年的養殖，國內養殖的大口黑鱸群體的遺傳多樣性顯著低于國外的野生群體［8］。因此本實驗室于2010年重新從美國引進大口黑鱸北方亞種野生群體，其遺傳多樣性較為豐富，遺傳改良潛力較大。雜交育種是獲得具有優良經濟性狀的養殖品種的有效途徑之一，能夠將親本的優良性狀轉移給子代［9］。本研究將大口黑鱸北方亞種引進群體和大口黑鱸“優鱸1號”進行自交和正反雜交，分析自交與正反交子代間的遺傳多樣性以及篩選生長優勢的組合，以期為大口黑鱸優良品種的培育提供基礎數據和參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

繁殖用的大口黑鱸“優鱸1號”和北方亞種引進群體親魚均來自中國水產科學研究院珠江水產研究所良種基地，北方亞種引進群體為2010年從美國引進的野生群體的第3代子代。2017年3月從兩個群體中分別挑選無病無傷、平均體質量為0.65 kg的1齡魚作為親魚，注射LRH-A2和DOM進行人工催產。每組繁殖所用親本數量均為80尾，雌雄比率1∶1，在水泥池中自然產卵受精，孵化出來的魚苗按照常規育苗方法進行培育［6］。為方便闡述，北方亞種自交群體、“優鱸1號”自交群體、正交群體［北方亞種（♀）ד優鱸1號”（♂）］、反交群體［“優鱸1號”（♀）×北方亞種（♂）］分別用N、G、NG和GN表示。生長對比實驗結束后，從每個群體挑選30尾剪取部分鰭條固定于95%的乙醇中備用。

1.2 微衛星引物

實驗所用的12對大口黑鱸SSR引物（表1）參考梁素嫻等［10］所篩選，具有較高的遺傳多態性。所有引物均由廣東艾基生物技術有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取鰭條樣品基因組DNA。提取的基因組DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，利用紫外分光光度計（Eppendorf公司AG2231型）檢測濃度，用ddH2O稀釋至50 ng·μL-1，保存于-20℃備用。

1.3.2 PCR反應條件及產物檢測

PCR反應體系總體積為20μL，分別包含：10 μL 2×MasterMix（Bioteke公司）、上下游引物（10 μmol·L-1）各 2μL、模板 DNA 1μL、ddH2O 5 μL。PCR擴增反應條件：94℃預變性3 min后進入35個循環，94℃變性30 s，退火45s，72℃延伸30 s，循環結束后72℃再延伸10 min，4℃保存。產物檢測委托上海捷瑞生物工程有限公司進行短串聯重復序列（STR）分型分析，具體方法為：將PCR產物與特異性熒光標記（FAM、HEX或ROX）混勻，后置于ABI3730XL測序儀（美國 ABI公司）樣本架上進行毛細管電泳檢測，數據采集，分析每個SSR引物在不同樣本中的條帶數確定各樣本基因型。

1.3.3 生長比較

為了比較自交與正反交子代在生長速度上的差異，在珠江水產研究所養殖基地的水泥池中進行生長對比實驗。待魚苗生長到體質量30 g左右時，從各個組中各挑選60尾規格接近的實驗魚，采用CWT對不同部位進行標記后同塘養殖，N、G、NG和GN群體注射位置順序依次為臀部、腹部、背部和頭部。實驗起止時間為3月齡至12月齡（2017年8月至2018年5月），期間5、8月齡和12月齡各測量一次數據，每組測量至少30尾魚。測量方法：使用電子天平稱量體質量、數碼相機拍照記錄魚苗生長狀態、魚類外部形態測量軟件測量魚體形態指標。

表2 4個大口黑鱸群體在12個微衛星位點中的遺傳多樣性信息Tab.2 Genetic diversity information of 4 M icropterus salmoides populations based on 12 m icrosatellite loci

1.4 數據統計及分析

根據每個個體PCR擴增條帶的大小確定其基因型，運用 Popgene32（Version 1.31）軟件分析各群體中每個微衛星位點的等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、遺傳分化指數F-統計量（Fst）以及 Nei’s遺傳距離（Ds）。基于等位基因頻率，運用PICCALC軟件計算每個位點的多態信息含量（PIC）。采用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析比較檢驗組間差異，以P＜0.05作為差異顯著。

生長數據分析所用公式為：

絕對增長率 （AGR）＝（W2-W1）／（d2-d1）

特定增長率 （SGR）＝100×（lnW2-lnW1）／（d2-d1）

式中，W1、W2分別為實驗天數d1和d2時實驗魚的體質量。

2 結果與分析

2.1 4個不同群體的遺傳多樣性分析

12對SSR引物在N、G、NG和GN 4個群體所有個體中均能擴增出清晰的條帶，共擴增出126個等位基因（表2）。除JZL60位點在G群體中表現為單態外，其他位點在大口黑鱸4個群體中均表現出多態性。N、G、NG和GN群體的平均等位基因數（Na）分別為 2.6、2.4、2.7和 2.8，平均有效等位基因數（Ne）分別為 2.1、2.0、2.3和2.1，平均觀測雜合度（Ho）分別為 0.519、0.480、0.729和 0.664，平均期望雜合度（He）分別為0.419、0.454、0.553和 0.519，平均多態信息含量（PIC）分別為 0.407、0.412、0.454和 0.425。4個群體中，NG群體的平均有效等位數、平均觀測雜合度、平均期望雜合度、平均多態信息含量均為最高，其遺傳多樣性最高，而G群體的遺傳多樣性最低。

2.2 不同群體間遺傳分化和親緣關系

大口黑鱸4個群體間的Fst統計量見表3，根據WRIGHT［13］提出的遺傳分化標準，GN群體與G群體的遺傳分化指數最大（0.149），達到中等分化；N群體與G群體的遺傳分化指數最小（0.019），分化很弱。4個群體的標準遺傳距離見表3，根據Nei’s計算群體的遺傳距離，N群體和G群體之間的遺傳距離最近（0.034），GN群體和G群體間的遺傳距離最遠（0.384）。將不同群體間的遺傳距離進行UPGMA聚類（圖1），結果顯示，N群體和G群體首先聚為一支，然后再與NG群體聚為一支，最后與GN群體聚合。

2.3 不同群體間的生長速度比較

各取樣月齡內，4個群體的體質量、體長和體高數據見表4。對不同群體間的各生長指標進行單因素方差分析，結果顯示均無顯著性差異（P＞0.05）。12月齡時 N、G、NG、GN群體的平均體質量分別為（388.22±72.08）、（372.50±83.51）、（400.12±89.36）、（419.91±66.82）g。在體質量和體高平均值方面，4個群體從大到小排序依次均為GN＞NG＞N＞G。生長速度比較見表5，4個群體的體質量日增長量隨著月齡的增加呈現先升高后降低，整個實驗期間AGR和SGR從大到小排列次序分別為GN＞NG＞N＞G和GN＞NG＞G＞N，結果顯示在生長速度方面GN群體最快，其次為NG群體。

表3 大口黑鱸4個群體的遺傳距離和遺傳分化指數Tab.3 Nei’s genetic distance and pairw ise F st among four M icropterus salmoides populations

圖1 大口黑鱸北方亞種引進群體、“優鱸1號”及其雜交子代的UPGMA聚類分析圖Fig.1 UPGMA clustering using Nei’s unbiased genetic distance（1978）of four M icropterus salmoides populations

表4 各采樣月齡內大口黑鱸4個群體的體質量、體長和體高的比較Tab.4 Comparation of grow th of body weight，body length and body height of four M icropterus salmoides populations

表5 各采樣月齡內大口黑鱸4個群體的體質量增長率Tab.5 Grow th rate of body weight of four M icropterus salmoides populations at different periods

3 討論

3.1 4個大口黑鱸群體的遺傳多樣性及遺傳分化

微衛星DNA又稱為短串聯重復序列，作為第二代分子遺傳標記技術，具有數量多、分布廣和共顯性等諸多優點，已成為分析生物遺傳多樣性和遺傳差異的有效工具［14-15］。豐富的遺傳多樣性是培育優良性狀品種的基礎，而明確不同群體間的遺傳距離和遺傳分化水平，對親本的選擇具有指導意義［16-17］。群體的遺傳多樣性主要表現在等位基因數的豐富程度、遺傳雜合度的大小和多態信息含量3個方面［18］。等位基因越豐富，遺傳雜合度越高，多態信息含量越高，說明群體的遺傳多樣性越豐富。本研究利用12對微衛星DNA對4個大口黑鱸群體檢測發現，無論從平均有效等位基因數還是平均期望雜合度、平均觀測雜合度、平均多態信息含量，NG群體的數值均是最高，表明NG群體的遺傳多樣性最高，其次為GN群體，說明通過雜交方式提高了雜交子代群體的遺傳多樣性。G群體的遺傳多樣性最低，可能是由于其奠基群體數量較少，連續多代的選育和自交使得遺傳多樣性出現了降低［19-20］。盡管如此，根據BOTSTEIN等［21］的劃分標準，大口黑鱸4個群體的多態信息含量均為中度多態（0.25＜PIC＜0.50），且兩個雜交子代群體高于兩個自交群體，說明雜交子代具有一定的雜種優勢和良種選育潛力。

親本間的遺傳距離越大，雜交子代的雜合位點越多，雜交優勢越明顯［22］。檢測大口黑鱸4個群體間Ds和Fst發現，N群體和G群體間的Ds和Fst均較小，其值分別為 0.034和 0.019，親本間遺傳分化較弱。大口黑鱸群體間的雜交方式不同，子代的遺傳表現也不相同。4個群體的Ds和Fst顯示，NG和GN群體均與N群體的遺傳距離更近，表明N群體對雜交子代的貢獻率大于G群體。

3.2 4個大口黑鱸群體的生長及雜種優勢

雜交可以將不同群體的優良性狀集中在一起，我國魚類雜交育種取得了不少的成果［9，23-24］。根據親緣關系的遠近，魚類的雜交可分為遠緣雜交（不同科、亞科、屬之間的雜交）和近緣雜交（同一物種不同品種、地理群體間的雜交）。關于大口黑鱸種間雜交的報道已有不少，但雜交子代在生長性能上是否具有優勢尚無定論，例 如：WILLIAMSON 和 CARMICHAEL［25］、PHILIPP和WHITT［26］使用大口黑鱸佛羅里達亞種和北方亞種雜交，1齡時北方亞種生長速度快，雜交種次之；KLEINSASSER等［27］研究表明佛羅里達亞種♀×北方亞種♂的雜交子代比兩親本的生長速度更快。種內雜交在大口黑鱸中尚未見相關報道，但在其他魚類和貝類中已有種內雜交優勢的報道。例如：河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）不同地理群體間的雜交子代的全長增加率、質量增加率、雜交優勢率均高于同一地理群體間的自繁子代［28］。張守都［29］使用海灣扇貝（Argopecten irradias）的加拿大群體和中國養殖群體進行不同地理種群間的雜交，發現雜交子代在成活率以及生長上具有顯著的雜種優勢；宋盛亮［30］使用長牡蠣（Crassostrea gigas）不同地理種群進行完全雙列雜交，6個雜交子代群體均顯示出雜種優勢。本研究結果顯示，大口黑鱸種內雜交無論是正交還是反交群體生長速度均快于親本群體，表明種內雜交是提高大口黑鱸生產性能的一個有效途徑。在生長性能方面GN群體優于NG群體，說明在后續的雜交育種過程中應選擇生長優勢更大的雜交組合方式。

綜上所述，大口黑鱸北方亞種引進群體與“優鱸1號”雜交后，在一定程度上提高了雜交后代的遺傳多樣性。大口黑鱸4個群體中，GN群體（“優鱸1號”♀ ×北方亞種♂）的生長速度最快，表現出一定的雜交優勢。本研究結果為大口黑鱸良種培育和遺傳改良提供了科學依據，同時也為大口黑鱸養殖產業的健康穩定發展提供了一定的技術資料。