海蜇Rhopilema esculentum 染色體及其核型分析

李云峰，孫巍，周賀，李玉龍，鮑相渤

（1.遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學，遼寧 大連 116023）

海蜇Rhopilema esculentum 隸屬于腔腸動物門，缽水母綱根口水母科海蜇屬，是經濟價值較高的大型食用水母，主要分布于中國、日本、朝鮮沿岸及前蘇聯遠東沿岸[1]。海蜇味道鮮美、營養價值高、抗逆性強，已成為我國海水養殖的重要種類。目前，有關海蜇的研究主要集中在基礎生物學[2-4]，營養及加工[5-7]、分子遺傳學[8-10]、人工養殖技術[11-14]等，對其細胞遺傳學研究很少。

染色體是細胞核中重要的組成部分，是生物發育、進化、遺傳和變異的物質基礎。染色體組型具有物種特異性和相對穩定性，能反映生物的遺傳組成、遺傳變異規律、發育機制、物種起源和進化歷史。郭平[15]研究表明海蜇染色體數2n=42。由于海蜇染色體體積微小，呈短棒狀，屬于微小染色體，進行染色體的核型分析比較困難，因此尚無對其核型方面的研究報道。本研究利用空氣干燥法制備海蜇的囊胚細胞染色體標本，采用Giemsa 和DAPI 兩種染色方法，首次獲得了較清晰的細胞有絲分裂中期的分裂相，并對其進行了數目統計及核型分析，旨在補充海蜇細胞遺傳學和細胞生物學方面研究的不足，并為海蜇品種選育和遺傳改良提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海蜇取自營口現代漁業產業園，均為傘徑（40±0.53）cm、體質量（5±0.47）kg 的性成熟個體。海蜇取回后暫養于遼寧省海洋水產科學研究院生物育種實驗室的孵化池，暫養期間停止投喂餌料。當孵化池底部出現大量受精卵時，將受精卵收集于燒杯中，置于顯微鏡下觀察，待海蜇胚胎發育至囊胚期收集于10mL 離心管中。

1.2 實驗方法

1.2.1 染色體制備

（1）秋水仙素處理：將發育至囊胚期的胚胎細胞收集于10mL 管內，加入終濃度為0.4g/L 的秋水仙素（無菌海水配置）于24℃處理45min，反復吸打。

（2）低滲：將細胞懸液于1000r/min 離心10min，去除上清后加入0.075mol/L 的KCl 溶液，27℃低滲45min，輕輕吹打數次。

（3）固定：去上清后，加入-20℃冰箱中預冷的現配置的卡諾固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定3次，每次15min，后置于-20℃中過夜處理。

（4）解離：-20℃中取出已經固定好的細胞懸液于1000r/min 離心2min，去上清，加入預冷的50%冰醋酸1～2 滴進行解離后，加入-20℃預冷的新配置的卡諾固定液。

（5）滴片：將細胞懸液在距冰凍載玻片上1m 左右的高度滴下，酒精燈火焰干燥。

（6）染色：將載玻片置于現配置的10%Giemsa（pH=6.8）染缸內染色30min，用蒸餾水沖洗干凈，或將載玻片用DAPI 染色，封片，染色24h，-20℃保存。

（7）觀察，將染色體標本在顯微鏡下觀察，在油鏡下拍照。

1.2.2 染色體核型分析

選取60 個數目清楚，形態清晰的染色體中期分裂相進行染色體眾數統計。選取5 個染色體數目完整且形態良好的中期分裂相，用Photoshop 軟件進行染色測量和配對，分析核型。依據Levan 等[16]的分類標準對染色體進行分組和命名：臂比值為1.0～1.7 為中部著絲粒染色體（m），臂比值為1.7～3.0為亞中部著絲粒染色體（sm），臂比值為3.0～7.0 為亞端部著絲粒染色體（st），臂比值大于7.0 為端部著絲粒染色體（t）。

2 結果與分析

2.1 海蜇胚胎細胞染色體數目

實驗選取60 個分散良好，形態清晰的海蜇囊胚期染色體中期分裂相計數染色體數目，由表1 可知染色體數目及所出現頻率，其中染色體數目2n=42 出現52 次，占有絲分裂細胞總數的86.7%，由此認為海蜇染色體數目為2n=42。

表1 海蜇囊胚期染色體數目Tab.1 The number of chromosome in blastula stage of R.esculentum

2.2 染色體核型分析

表2 海蜇染色體組型數據Tab.2 Karyotypes of R.esculentum

實驗選取海蜇胚胎細胞制備染色體標本，經Giemsa 和DAPI 染色后，在顯微鏡下觀察到了清晰的有絲分裂中期分裂相。海蜇囊胚期有絲分裂中期的染色體形狀為短棒狀（圖1），由染色體相對長度（相對長度=每條染色體長度/單倍染色體長度×100）和臂比值可知，海蜇染色體組成為中部著絲粒染色體（m）10 條，亞中部著絲粒染色體（sm）14 條，亞端部著絲粒染色體（st）12 條，端部著絲粒染色體（t）6 條（表2），海蜇染色體核型公式為2n=42=10m+14sm+12st+6t，NF=78。

3 討論

目前，制備腔腸動物染色體所用組織，主要有胚胎[17]、螅狀體、碟狀體[15]、觸手[18]及整體浸泡[19]等。本研究采用海蜇發育至囊胚期的胚胎細胞做為實驗材料，因其具有細胞大，有較高的有絲分裂指數，且實驗重復性好的特點，因此制片中了獲得大量清晰的細胞分裂中期分裂相。關于海蜇染色體核型的研究很少，早期研究者[15]只報道了海蜇染色體數目，未提供核型公式。本研究除采用Giemsa 染色方法以外，還采用DAPI 染色制備海蜇染色體圖譜。DAPI 是一種特異性強，靈敏度高的熒光染料，其與DNA 形成的復合物能發出穩定的淺藍色熒光，便于顯微照相觀察[20,21]。將圖1 中a、b 及已報道的圖片相比較可以發現相比于Giemsa 不容易上色，DAPI染色方法使染色體輪廓更為明顯，更有利于染色體的核型分析，為海蜇等染色體形態小、著絲點位置不明顯的種類的染色體數目確定及染色體定位等細胞學研究奠定了技術基礎[22]。

本實驗選取60 個分散良好、形態清晰的海蜇囊胚期染色體中期分裂相計數染色體數目，研究確定了海蜇染色體數目為2n=42，染色體呈短棒狀，這一數目與郭平[15]的研究結果相同，而少于海月水母Aurelia aurita[18]2n=44，多于水螅綱的廈門隔膜水母Leuckartiara hoepplii Hsu 2n=30[19]。有研究表明[22,23]染色體的數目可以作為物種進化過程中親緣關系判定的依據，本研究總結出相對準確的海蜇核型公式為2n=10m+14sm+12st+6t，NF=78，染色體大小差別不明顯，這與海月水母Aurelia aurita 2n=44m，NF=88 及國外學者[24,25]報道的水螅Pelmatohydra oligactis 和P.baikalensis，2n=30，NF=56，且染色體大多為中部和亞中部著絲粒染色體的結果有很大差別。有研究[26]指出在分類階元中，具有較多端部著絲粒染色體的是原始類群，而具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的是特化類群，這一觀點證明了海蜇在腔腸動物中是原始類群。

本研究獲得了海蜇染色體的準確數目及核型，此結果將為染色體操作育種、雜交育種等育種方法在海蜇遺傳改良方面提供依據，并為海蜇染色體基因定位、細胞遺傳學等遺傳基礎研究奠定基礎。