魚類卵母細胞減數分裂機制研究進展

史秀蘭，徐革鋒，黃天晴，谷偉，程琳，姚作春，陳春山，王麗薇，王炳謙

（1.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱150070 2.上海海洋大學水產與生命學院，上海200120 3.北京市水生野生動植物救護中心，北京 102110）

1 魚類減數分裂分子機制

1.1 減數分裂的啟動

目前，人們廣泛研究了魚類減數分裂的啟動機制。魚類在繁衍過程中，為使得親代與子代的染色體數目恒定，遺傳物質穩定遺傳，在配子形成中，生殖細胞會發生精確的減數分裂，而魚類性別決定和生殖細胞的分化正與這過程相關。

減數分裂的啟動時間與魚類性別分化密不可分[1]。對哺乳動物的研究表明，若是形成卵母細胞，減數分裂在胚胎期發生；若形成精母細胞，減數分裂在出生后發生。在13.5dpc（days post copulation，DPC）左右時，雌雄小鼠生殖細胞開始出現形態學差異。這時卵原細胞開始啟動減數分裂，在胚胎時，卵原細胞增殖，且已經歷了減數分裂的細線期、偶線期和粗線期，之后在雌鼠性成熟時卵母細胞將停滯在雙線期，隨之在卵泡刺激素、黃體生成素、雌激素等共同作用下，停滯在減數第一次分裂的初級卵母細胞重新啟動減數分裂，最終排出成熟的卵子。雄性小鼠與雌鼠不同，精原細胞在胚胎期并不啟動減數分裂，在胚胎發生后期就進入靜息狀態。脊椎動物生殖細胞減數分裂的啟動時間與最終發育成卵子還是精子有關[2]。有研究表明，從魚類生殖細胞減數分裂啟動時間來看，雌性明顯早于雄性，如尼羅羅非魚Oreochromis niloticu 雌性卵巢生殖細胞的減數第一次分裂大約在孵出后30d，而雄性精巢生殖細胞到孵化后70d 左右時開始減數分裂[3]。這一結論，還需要進一步探討。

1.2 減數分裂信號通路

魚類卵母細胞的發育和成熟是由垂體促性腺激素，卵巢衍生生長因子和性類固醇共同進行復雜的協調。眾所周知，類固醇激素，尤其是雌激素和孕激素，分別與卵母細胞生長和減數分裂恢復有關[4]。卵母細胞從減數分裂開始到成熟卵子排出受各通路的調控。這些通路調控著減數分裂的啟動、阻滯與恢復，其最新研究進展概述如下。

1.2.1 RA 信號通路

近幾年，對哺乳動物減數分裂通路的研究成果（圖1）運用到魚類的研究中，表明視黃酸（Retinoic Acid:RA）可能是MIS（feminizing meiosis-inducing substance，MIS）的類似物[5]，是視黃醇（retinol，ROL）在體內發生代謝后產生的主要活性物質，這種活性對生長發育和機體免疫系統有重要作用，同時若RA 過度增加對細胞的增殖分化有產生抑制作用。RA 的合成分為兩步，第一步為以視黃醇為底物發生氧化還原反應，由醇脫氧酶（alcohol dehydrogenases，ADHs）和視黃醇脫氧酶（retinol dehydrogenases，RDHs）進行催化，將ROL 轉化成視黃醛（retinal），第二步在視黃酸脫氫酶（RALDH）和RA 合成酶ALDH1A 家族（ALDH1A1、1A2 和1A3）的催化下將視磺醛轉化成RA[7]。RA 由肝臟分泌的視黃醇結合蛋白（retinal-binding protein，RBP4）在血清中攜帶，釋放后被周圍細胞吸收。而RA 的分解由三種細胞色素P450（CYP26）酶（CYP26A1[8]、CYP26B1[9]和CYP26C1[10]）完成。在細胞色素P450s 酶少或沒有時，細胞核RA 受體（retinoic acid receptor，RAR）與RA 結合，促進RA 調控的發育靶基因轉錄。RAR 與RA 類受體（retinoid X receptors，RXR）形成異二聚體結合到RA 反應元件（RARE）上，所構成的三元復合物通過改變共壓因子和與輔激活因子的結合來調控靶基因轉錄（圖2）。蔣汶洮[12]研究發現，羅非魚中具有完整且獨立的RA 的信號通路，雌性羅非魚減數分裂的起始需要內源RA 的合成，雌激素對性腺中RA 水平也有調節作用，硬骨魚類和其他脊椎動物的減數分裂可能都需要RA，分解酶或合成酶影響RA 含量。

1.2.2 DHP 信號通路

孕激素（DHP）在生殖細胞發生減數分裂順利排出成熟配子過程中發揮重要作用。迄今為止，發現具有生物活性的孕激素僅兩種，即17,20β-DHP和20β-S。其中，絕大多數硬骨魚類的孕激素是17,20β-DHP，少數是20β-S[13]。

目前多種硬骨魚類的核受體Pgr（Progesterone receptors，PGR）已被克隆出來，且細胞表達模式依魚種類的不同而異[14-16]。Chen 等[14]對哺乳動物細胞系的離體培養試驗表明Pgr 最主要的配體是DHP，結合進入細胞核進行轉錄并激活下游基因的表達。在魚類卵母細胞減數分裂過程中，成熟促進因子MPF、成熟誘導激素MIH 和促性腺激素LH 三者共同發揮關鍵的誘導調控作用。三者的作用機制是：促性腺激素進入卵泡濾泡層細胞，在相關的內固醇合成酶作用下合成成熟誘導激素，成熟誘導信號經過環腺苷酸（cAMP）通路驅動成熟促進因子的一個調節亞基的合成途徑，由產生的成熟誘導因子作用下游靶基因，使停滯的減數分裂過程得以恢復[17]。在魚類卵母細胞成熟和成熟卵子排出時期，合成17β-雌二醇（estradiol-17β，E2）到合成DHP 存在迅速轉變過程，在排卵前的48h，卵泡會有從分泌E2 到分泌DHP 的轉變，在血清中DHP 含量達到峰值時，使得卵子最終成功排出[18]。劉剛[19]報道，核受體Pgr 基因在減數分裂啟動的關鍵時期特異表達于精巢和卵巢中，若阻斷了DHP 信號通路，魚生殖細胞數量顯著減少，由此可推斷DHP 通過其核受體Pgr 在硬骨魚類減數分裂啟動過程中起到關鍵作用。

1.2.3 cAMP 信號通路

魚類性成熟過程中，卵母細胞停留在減數第一次分裂前期，在這期間，高濃度cAMP 協同類固醇激素（如孕酮P4）或其他成熟抑制因子維持減數分裂的停滯。對cAMP 信號通路，即第二信使的雌激素信號通路的研究已經非常透徹了。在卵母細胞減數分裂過程中，Gαs蛋白在其耦聯受體3（Gs-protein-coupling receptor 3，GPR3）作用下，活化腺苷酸環化酶（AC）促進cAMP 的合成，使cAMP 在卵母細胞內的濃度變高，減數分裂停滯[20]。黃體生成激素（LH）的釋放使GPR3 的配體失活或合成減少，導致GPR3 的活性降低；隨后G蛋白受體激酶再通過磷酸化GPR3下調其活性，減數第一次分裂得以恢復。近幾年的研究發現，不同生物體內cAMP 信號的通路不同。

研究發現，非洲爪蟾Xenopus laevis 卵母細胞cAMP 通路中，cAMP 降低水平與減數分裂停滯的釋放無關；膜通道檢測時，cAMP 或PKA 的變化并未隨孕酮（P4）的改變而改變，減數分裂停滯后，PKA活性不會發生變化，增加cAMP 水平不會影響卵母細胞成熟的水平[21]。對于硬骨魚類，體外添加外源性雌二醇（E2）的濃度越高，卵母細胞內檢測到的cAMP 濃度越高，從而卵母細胞的成熟受到抑制[22]。研究已證實，E2 主要通過與其膜受體-G 蛋白偶聯雌激素受體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）結合來調控魚類卵母細胞減數分裂的阻滯和恢復。Thomas 等研究發現，用芳香酶抑制劑體外培養的大西洋黃花魚Micropogonias undulatus 和斑馬魚Danio rerio 細胞自發成熟水平增加，添加外源E2 的作用是可逆的。同樣，通過向培養基中添加E2，可以減弱MIS 誘導的卵母細胞成熟[23,24]。手動或酶促剝離卵母細胞卵泡層，以去除其內源性雌激素源干擾，顯示出成熟率增加。研究結果表明，這與雌激素對魚的減數分裂細胞周期進程中的抑制作用一致。

最近的研究表明，在這種通路中，雌激素對魚卵母細胞成熟的抑制是通過其跨膜受體，即GPER介導的。繼哺乳動物研究之后，Peyton 和Thomas 的研究表明，雌激素對卵母細胞成熟的抑制作用是通過Gper 介導的[25]。GPER 先前定位于卵母細胞表面，在卵母細胞表面高度表達。Peyton 和Thomas 證實[26]，缺乏雌激素的斑馬魚卵母細胞表現出高度的自發成熟。添加E2-牛血清蛋白（不含膜的雌激素）阻斷了卵母細胞的自發成熟。進一步的研究表明，GPER特異性激動劑（G-1）減弱了自發性卵母細胞的成熟，且GPER 特異性拮抗劑（G-15）阻斷了E2 對卵母細胞成熟的抑制作用。脊椎動物（哺乳動物和魚類）的驗證表明，GPER 的基本功能作為膜雌激素受體這一觀點取得了更有力的支持[27]。

2 魚類減數分裂特異性基因

近幾年，關于Stra8、Scp3、Dmc1 和Spo11 等減數分裂特異性基因的研究逐漸增多，相關信號通路的驗證往往與特異性基因分不開。研究者們致力于探究減數分裂各個時期的啟動時間、發生過程以及各通路之間的相互影響和作用的同時，也在尋找與減數分裂相關的特異性表達基因。這里著重介紹幾個調控魚類減數分裂的特異性基因。

對哺乳動物和鳥類的研究發現，有絲分裂結束開始減數分裂前，Stra8 基因是這時期的特異性表達基因，在調控減數分裂的起始過程中起非常重要的角色。若Stra8 缺失，生殖細胞將不能完成減數分裂[28-30]。早期，對青鱷Crocodylus siamensis、斑馬魚Danio rerio、紅鰭東方鲀Takifugu rubripes 和黑青斑河鲀Tetraodon nigroviridis 等的基因組序列分析中，并沒有發現Stra8 的同源基因[31]。近幾年，焦靜等[32]從幾種硬骨魚類，如溝鲇Parasilurus asotus、虹鱒Onchorrhychus mykiss 等魚中分離到了基因Stra8，其在性腺中特異性地表達，說明Stra8 基因在減數分裂啟動中的重要作用。

Dmc1（Disrupted meiotic cDNA）是在減數分裂前期偶線期表達的特異基因,其表達產物為同源染色體配對時所必需。Dmc1 蛋白在真核生物中發現，是大腸桿菌Escherichia coli RecA 蛋白的同源蛋白。Dmc1 基因是減數分裂重組和聯會復合體（Synaptonemal complex,Sc）的關鍵組分[33,34]。早期研究人員發現DMC1 蛋白是哺乳動物細胞減數分裂特異的重組蛋白，僅在精原細胞和胚胎時期的卵母細胞中表達。小鼠Dmc1 基因在減數分裂Ⅰ細線期到偶線期的過程中特異表達，為同源染色體聯會配對必需[35]。若Dmc1 基因突變或者被敲除，直接導致減數分裂停滯在偶線期，不出現同源染色體聯會或者出現異常聯會[36]。在魚類研究中，如日本鰻鱺Anguilla japonica、紅鯽Carassius auratus red var.、湘江野鯉Cyprinus carpio L.、日本白鯽Carassius cuvieri、湘云鯽和鯽鯉等魚類中發現，Dmc1 基因僅在減數分裂間期早期表達[37]。在陶敏等研究發現，Dmc1 基因在不同倍性鯽鯉中的表達與倍性無顯著相關性[38]。

聯會復合體（Synaptonemal complex，SC）是一種框架狀結構的蛋白復合體，發生在配子形成過程中減數分裂偶線期同源染色體配對時形成的一種核內臨時結構[39]。這種聯會復合體蛋白質（Synaptonemal complex protein，SCP）由Scp1、Scp2 和Scp3 三種蛋白構成[40-42]。其中Scp1 是主要構成SC 的中心和軸向蛋白[43,44]。而Scp2 和Scp3 則是主要組成SC 的橫向蛋白[45-47]，其中Scp3 具有DNA 結合位點，廣受學者們的關注。SCP 最早在減數分裂前期的細線期形成，雙線期消失；SCP 與同源染色體的凝集、配對、重組以及雙鏈斷裂密切相關[48,49]。若SCP 基因缺失，減數分裂不能進入后期或出現非整倍體配子。近幾年，研究者們已經分析和驗證了哺乳動物如大小鼠、牛、絨山羊等以及人的Scp3 基因功能。在硬骨魚類中，目前在虹鱒[50]、青鳉Oryzias latipes[51,52]、斑馬魚等模式魚中有研究，證明Scp3 基因僅在性腺中表達，可作為減數分裂特異性標記基因。

Spo11 是減數分裂粗線期染色體重組過程中不可或缺的蛋白，參與DNA 雙鏈斷裂復合物（Double-Strand breaks，DSB）的形成。近幾年，已在多種脊椎動物克隆了Spo11 基因，可推斷此基因可能在其他物種減數分裂進程中具有保守功能[53，54]。但在日本鰻鱺Anguilla japonica 中發現，Spo11 基因僅在精母細胞中有表達，而在卵黃發生早期沒有發現[54]，表明Spo11 基因在硬骨魚類的表達模式與其他物種并不完全一致。尚婉婧等[55]對尼羅羅非魚的研究表明，Spo11 基因僅在性腺特異性地表達，且雌性生殖細胞的表達早于雄性。Spo11 基因適合作為性腺分化早期，生殖細胞減數分裂的標志基因。

3 展望

近年來，對卵母細胞減數分裂過程調控機制的研究日益增多，面對這一應用基礎領域的熱點及難點，國內外學者們不只局限于植物和哺乳動物的研究，在兩棲動物如爪蟾，硬骨魚類的探究也越來越多。多倍體魚類不育，在生長過程中較正常二倍體具有更多的生長優勢。研究二者在減數分裂過程中的差異是關鍵的一步。減數分裂的啟動過程，與魚類性別分化和性腺發育的關系密不可分，從這一方面入手，有利于實現人工控制魚類倍性，對提高生產經濟效益有突出貢獻。