山東省番茄潰瘍病病原菌的分離與鑒定

蘇曉梅　劉淑梅　李嘉琦　王施慧　侯麗霞

摘要：本試驗對山東省內不同地區番茄潰瘍病發病情況進行調查，采集具有典型癥狀的病樣，采用組織分離方法分離純化病原菌，并對其進行形態學觀察、分子生物學鑒定和致病性測定。結果表明，不同地區番茄病樣分離得到的4個菌株均屬于潰瘍病菌Cmm，但致病力存在差異。本研究可為番茄潰瘍病的準確鑒定和病害防治提供參考。

關鍵詞：番茄潰瘍病;Cmm;病原菌;分離鑒定

中圖分類號：S436.412.1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2020）05-0100-05

Abstract In this experiment， the incidence of tomato bacterial canker disease was investigated in different areas of Shandong Province. The diseased samples with classical symptom were collected， and then the pathogen was isolated by tissue-isolation method and the morphological characteristics， molecular identification and pathogenicity test were conducted. The results showed that four strains were obtained from the investigated areas in Shandong Province. All they belonged to Cmm with different pathogenicity. This research could provide references for the identification and control of tomato bacterial canker.

Keywords Bacterial canker of tomato;Cmm;Pathogen;Isolation and identification

番茄潰瘍病（bacterial canker of tomato）是一種由細菌侵染而引起的維管束病害，病原菌為密執安棒形桿菌密執安亞種（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm），可侵染辣椒、龍葵、裂葉茄及其它番茄屬植物。番茄潰瘍病的主要癥狀包括葉片邊緣壞死、葉片萎蔫至枯死;莖和葉柄出現褐色條斑，病斑下陷、開裂而露出髓腔，呈潰瘍狀以及維管束變褐等;果實出現圓形病斑，中央淺褐色、邊緣為白色暈圈，形似鳥眼狀，可聯合成不規則斑塊[1]。該病害在番茄生育期內均可發生，特別是溫暖潮濕條件更易造成該病的大規模暴發與流行。我國于1985年首次在北京市平谷發現番茄潰瘍病[2]。1993年東北地區也報道了該病發生[3]。2002年，安徽省國寧市方塘鄉番茄潰瘍病發病率超過80%。2007—2009年，該病給貴州省修文縣造成的產量損失達40%～50%[4]。近年來，隨著氣候的異常變化及番茄種植規模擴大，番茄潰瘍病在黑龍江、吉林、遼寧、內蒙古、新疆、河北、河南、山東、上海、海南、重慶、湖北、貴州等省區均有不同程度發生，且逐年加重，這對番茄生產造成一定影響[1，5-8]。

本研究對山東省不同地區番茄潰瘍病田間發病情況進行調查，采集病樣進行病原菌分離與純化，并對分離得到的病原菌進行形態學觀察、分子生物學鑒定以及致病性測定，以明確不同地區番茄潰瘍病菌的致病力差異，為番茄潰瘍病的鑒定、防治及探索該病病原菌的多態性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試培養基： 523液體培養基：每升含10 g蔗糖、8 g水解酪素、4 g酵母浸膏、2 g K2HPO4、0.3 g MgSO4·7H2O。523固體培養基：在上述523液體培養基基礎上添加15 g瓊脂。培養基用前高壓滅菌，且pH值調整為6.9～7.1。

病原菌致病性測定試驗所用番茄品種Heinz 1706，種植于32孔穴盤，待長至三葉一心時進行處理。

1.2 田間調查及病樣采集

于2018—2019年調查山東省泰安市岱岳區、濟南市濟陽區、蒙陰縣、壽光市等地番茄潰瘍病發病情況，選擇典型病株，觀察、記錄病害癥狀，并將病樣帶回實驗室進行病原菌分離。

1.3 病原菌分離培養及形態觀察

采用常規組織分離法對病原菌進行分離。具體步驟：使用滅菌解剖刀切取病健交界處1～2 cm莖段，先用無菌水沖洗干凈，再經1% NaClO 溶液消毒5 min，后用無菌水清洗3次;將消毒后莖段置于滅菌培養皿中，加1～2滴無菌水，擠壓使組織液滲出;用滅菌接種環蘸取組織液在523固體培養基平板上劃線：先在平板的一側順序劃3～5條線，再將培養皿轉60°，從第二條線末端順序劃3～5條線[9]。后置于 28℃恒溫箱中培養2～3 d后，挑取疑似潰瘍病菌落進行純化培養，觀察、記錄菌落形狀、大小、顏色等形態特征。

1.4 病原菌分子生物學鑒定

挑取純化后菌落至523液體培養基中，28℃、200 r/min振蕩培養12 h后，6 000 r/min離心2 min，棄上清，菌體用無菌水洗滌2次后，重懸于無菌水中備用。

以上述重懸菌體為模板，采用表1中引物進行PCR擴增。反應體系（10 μL）：菌懸液 2 μL，上、下游引物各0.25 μL，2×Taq Mix 5 μL，ddH2O 2.5 μL。反應程序：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個循環;72℃延伸5 min，16℃保存。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京六合華大基因科技有限公司測序。利用NCBI數據庫的Blast程序對測序結果進行比較。

1.5 病原菌致病性測定

將純化后各病原菌分別轉至523液體培養基中，28℃、200 r/min 振蕩培養12 h后，將各菌懸液濃度調至108～109 cfu/mL。采用打頂法接種，將手術剪前端1 cm處蘸取菌懸液，在幼苗新葉處將主莖剪斷[14]，以蘸取無菌水為對照，每份菌懸液接種8株，重復3次。接種后，先將植株置于28℃環境中（RH為90%～100%）保濕48 h，再進行正常管理（白天25～28℃、夜晚20～22℃，平均濕度80%～90%），20 d后觀察病情發展情況。

2 結果與分析

2.1 山東省不同地區番茄潰瘍病的田間發病情況

經調查發現，不同地區番茄病株表現癥狀一致，均為下部葉片先出現染病癥狀，后逐漸向頂端蔓延。該病進一步擴展時，葉柄、側枝或主莖出現灰褐色條斑，后期莖部略變粗、表面產生許多不定根或刺狀突起、開裂，髓部中空變褐，全株枯死;果實出現典型的“鳥眼斑”癥狀，即病斑中央產生黑色小斑點并伴有白色暈圈，多個病斑融合使果實表面粗糙（圖1）。

2.2 病原菌分離與形態學鑒定

本試驗從不同地區番茄病樣中分離得到4株菌株。培養3 d后，各菌株形態基本相同：菌落呈凸圓形，黃色，表面平滑，邊緣無鋸齒，粘稠狀，直徑為1～3 mm（圖2）。根據形態學特征，初步鑒定4個菌株均為番茄潰瘍病菌Cmm。

2.3 病原菌分子生物學鑒定

由圖3可以看出，不同引物均能擴增出特異條帶，大小與預期一致，而對照無條帶。將引物27F/1492R擴增得到的產物進行測序，經Blast比對，發現其與HQ144241.1（已知Cmm序列的GeneBank登錄號）同源性達99%以上（圖4）。因此，分離獲得的病原菌為番茄潰瘍病菌Cmm。

2.4 病原菌致病性鑒定

由圖5可以看出，接種濟陽、蒙陰、壽光分離菌株的番茄幼苗明顯出現萎蔫、死亡癥狀。其中接種濟陽分離菌株的幼苗癥狀最重，所有植株均死亡，接種蒙陰分離菌株的幼苗癥狀次之，接種壽光分離菌株的8株幼苗中有3株萎蔫死亡、5株萎蔫，而接種岱岳分離菌株的幼苗無明顯發病癥狀，僅在接種傷口處出現萎蔫，個別葉片發生萎蔫。因此，不同地區的番茄潰瘍病菌株致病力強弱存在差異。

3 討論與結論

本試驗采集山東省內主要番茄產區的番茄潰瘍病樣，并從中分離獲得純化菌株。根據形態學觀察和分子生物學鑒定結果，證實所得菌株均為Cmm。這與其它地區所報道[5，7]的番茄潰瘍病菌一致。然而，本研究樣本僅采自山東省，存在一定局限性。但引起番茄潰瘍病的病原菌并沒有生理小種分化，只是致病力有所差異。這與前人的研究[15-17]基本一致。因此，下一步應擴大采集和鑒定國內番茄產區的潰瘍病菌，對其遺傳多樣性及致病性差異進行分析。另外，番茄潰瘍病菌Cmm的測序工作已經完成[18]，可充分利用基因組數據信息，在病原菌的致病機制和寄主的抗病機理及闡明二者互作機制方面開展研究，從而更好地為該病害防治提供參考。

近年來番茄潰瘍病已成為我國番茄生產的重大威脅，許多國家已將其列為檢疫性病害。目前，該病害主要以預防為主，生產中尚無有效防治藥劑，而培育抗病品種是有效的防治手段。本研究對番茄潰瘍病菌進行分離鑒定以及致病力測定，這是進行番茄潰瘍病抗性鑒定的前提，下一步還需建立完善的苗期接種鑒定體系以及篩選鑒定番茄種質資源，更好地為番茄潰瘍病的抗病育種及利用研究奠定基礎。

參 考 文 獻：

[1] 李煥玲，石延霞，謝學文，等. 李寶聚博士診病手記（四十二） 番茄潰瘍病的發生規律與防治技術[J]. 中國蔬菜，2011（23）： 24-27.

[2] 劉泮華，張樂，李明遠. 北京市發生番茄潰瘍病（簡報） [J].植物保護，1986，12（1）：32-33.

[3] 趙廷昌，王克，白金鏜，等. 東北地區番茄細菌性潰瘍病的發生和病原鑒定研究[J]. 植物病理學報，1993，23（1）：29-34.

[4] 石延霞，張珊珊，黃大野，等. 李寶聚博士診病手記（二十三） 貴州省修文縣番茄“火燒疫”病原鑒定[J]. 中國蔬菜，2010 （7）：18-19.

[5] 李江利，歐陽林杰，郭淼淼，等. 河南省番茄潰瘍病的發現與分子確診[J]. 河南農業大學學報，2011，45（3）：349-352.

[6] 祁占東. 承德地區番茄潰瘍病發生特點與綜合防治技術[J]. 中國蔬菜，2014 （1）：71-72.

[7] 陳磊，羅金燕，趙玉強，等. 上海市番茄潰瘍病的確診及其防控對策[J].浙江農業科學，2016，57（12）：2054-2057.

[8] 康華軍，溫智浩，袁軍海，等. 新疆加工番茄細菌性斑點病與潰瘍病復合侵染鑒定及防治建議[J]. 中國蔬菜，2018 （6）：83-86.

[9] 曹春梅，徐利敏，胡俊. 25個番茄品種抗細菌性潰瘍病室內測定[J].內蒙古農業科技，2008（2）：30-32.

[10]Dreier J，Bielefeld U， Biologie F. Southern hybridization and PCR for specific detection of phytopathogenic Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis[J]. Phytopathology，1995，85：462-468.

[11]Pastrik K H，Rainey F A. Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reaction-based techniques[J]. Journal of Phytopathology，1999，147（11/12）：687-693.

[12]趙文軍， 夏明星， 陳紅運， 等. 番茄潰瘍病菌PCR快速檢測技術[J]. 植物檢疫，2007，21（2）：75-77.

[13]張慶萍，王燕春，趙偉強，等. 番茄潰瘍病病原菌遺傳多樣性分析[J]. 北方農業學報，2017，45（6）：20-23.

[14]羅來鑫，李健強，Bolkan H. 番茄細菌性潰瘍病苗期接種新方法的研究[J]. 植物病理學報，2005，35（2）：123-128.

[15]王蕊，羅來鑫，李健強. 不同來源番茄潰瘍病菌致病力差異研究[J]. 植物保護，2010，36（1）：73-76.

[16]Milijaevic'-Marcˇic' S，Gartemann K H，Frohwitter J，et al. Characterization of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis strains from recent outbreaks of bacterial wilt and canker in Serbia[J]. European Journal of Plant Pathology，2012，134：697-711.

[17]張慶萍，王燕春，徐佳，等. 番茄潰瘍病病原菌致病性的鑒定[J]. 北方農業學報，2016，44（6）：26-30.

[18]Gartemann K H，Abt B，Bekel T， et al. The genome sequence of the tomato-pathogenic actinomycete Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB382 reveals a large island involved in pathogenicity[J]. Journal of Bacteriology，2008，190（6）：2138-2149.