靈芝孢子提取物對肺腺癌細胞順鉑化療敏感性及TAZ表達的影響

王 偉，郭 雯，董海北，許猛軍，馬高磊，吳小進

非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的80%，盡管對其治療取得了一定的進步，但晚期NSCLC患者的預后仍然很差[1-2]。自靶向治療出現以來，晚期NSCLC的治療方法可能會發生變化，但基于順鉑的雙線藥物仍然是大多數晚期NSCLC患者治療的基礎，肺腺癌在NSCLC中占比最高。而對順鉑藥物的抗性已經成為影響肺癌治療效果的主要因素。為了克服耐藥性，已采用二線或聯合化療方案，但NSCLC中各種化療的總體生存獲益尚不令人滿意[3-4]。靈芝孢子提取物含有大量多糖、三萜類化合物、黃酮類化合物、香豆素、醌、類胡蘿卜素、氨基酸，具有免疫調節、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗癌等作用。近期研究發現，靈芝孢子提取物具有抗腫瘤和免疫調節作用，是結腸癌、早幼粒細胞白血病、胃癌等各種癌細胞的體外抑制劑[5-6]。具有PDZ結合域的轉錄共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ)是Hippo途徑的關鍵轉導因子，該途徑是器官大小、干細胞維持和腫瘤發生的重要調節劑。TAZ主要通過TEAD轉錄因子家族來刺激促進細胞增殖和控制器官大小基因的表達[7]。最近的研究一致表明，TAZ和(或)其旁系同源YAP的上調賦予了對多種細胞毒劑如抗微管蛋白、抗代謝物和DNA破壞劑的抗性[8]。已有研究證明，TAZ在乳腺癌細胞中過表達誘導對紫杉醇和阿霉素的耐藥性，其靶基因CYR61和CTGF的上調有助于耐藥性的發展[9]。本研究擬探討靈芝孢子提取物對肺腺癌H1299細胞順鉑化療敏感性及TAZ表達的影響，為肺腺癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 10%胎牛血清、Trizol試劑(美國Invitrogen公司，批號：R6081、R2078)；靈芝孢子提取物、DMEM培養基、RIPA緩沖液、聚偏氟乙烯膜(美國sigma公司，批號：S05167、S10262、S11825、S09156)；順鉑、細胞計數試劑盒8(CCK-8)、結晶紫染液(碧云天生物技術研究所，批號：181026、181022、181103)；4%多聚甲醛、化學發光檢測試劑(德國默克公司，批號：DM4419、DM5013)；Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京福麥斯生物技術有限公司，批號：M0917)；Transwell室(美國Chemicon公司，批號：CA55671)；SYBR?PrimeScript?PLUS RT-RNA PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司，批號：B0816)；10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(美國賽默飛世爾科技公司，批號：MS66179)；抗TAZ抗體、抗GAPDH抗體(美國CST公司，批號：C6317、C7059)；辣根過氧化物酶偶聯的二抗(美國Abcam公司，批號：ab09486)。ELx800酶標儀(美國Bio-Tek公司)；奧林巴斯BX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；AS-90流式細胞儀(美國賽默飛世爾科技公司)；ABI7500實時PCR檢測系統(美國通用公司)；Molecular Imager系統(美國Bio-Rad公司)；數字圖像分析系統(美國Media Cybernetics公司)。

1.2細胞培養 肺腺癌H1299細胞購自中國科學院(上海)細胞庫，細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，培養環境為37℃以及5% CO2。

1.3細胞分組 H1299細胞組如前所述常規培養，不做任何處理；順鉑組的培養方法同H1299細胞組，加入順鉑，使順鉑最終濃度為40.0 μg/ml(預實驗順鉑對H1299細胞的半數致死濃度為80.0 μg/ml，以1/2半數致死濃度為作用劑量)；靈芝孢子提取物組培養方法同H1299細胞組，加入靈芝孢子提取物，使靈芝孢子提取物最終濃度為80.0 μg/ml(預實驗靈芝孢子提取物對H1299細胞的半數致死濃度為160.0 μg/ml，以1/2半數致死濃度為作用劑量)；聯合組的培養方法同H1299細胞組，加入順鉑40.0 μg/ml以及靈芝孢子提取物80.0 μg/ml；上述各組細胞置于CO2培養箱(37℃、5% CO2、2% O2、93% N2)培養。以上各組每孔設6個平行樣，培養72 h。

1.4細胞增殖及單克隆形成數目測定 CCK-8檢測試劑盒用于檢測細胞增殖，根據試劑說明書的操作方法，收集培養結束時各組H1299細胞，使用ELx800酶標儀在450 nm波長測量OD值。細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)×100%。細胞克隆形成測定，收集培養結束的各組H1299細胞接種在6孔板(1×103個/孔)中，并培養10 d。每3天更換1次培養基，用4%多聚甲醛固定細胞，并用結晶紫染色，在顯微鏡下計算細胞克隆形成數目。

1.5細胞凋亡測定 Annexin V-Alexa Fluor 647/PI細胞凋亡檢測試劑盒用于檢測細胞凋亡，各組H1299細胞培養結束后，用膠原酶消化細胞，收集細胞并將其重懸于結合緩沖液中，將細胞用膜聯蛋白V-Alexa Fluor 647和PI染色，然后在室溫下孵育15 min，使用AS-90流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.6細胞侵襲遷移能力測定 ①細胞侵襲測定通過使用帶有8 μm孔徑插入物的Transwell室進行。在200 μl無血清培養基中將各組H1299細胞(2×104個)接種到頂室中，并將600 μl完全培養基添加到底室。培養12及24 h后，分別將細胞用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色。從5個隨機選擇的區域計數穿膜細胞數，然后取平均值。②傷口愈合試驗測定遷移率，將各組H1299細胞接種在6孔板上，加入無血清培養基再孵育24 h，用200 μl移液器鈍頭在每個孔中進行一次刮擦，使用倒置顯微鏡在12 h后對細胞進行成像。使用Image J 1.47軟件計算傷口閉合的百分比(遷移率)。

1.7細胞TAZ mRNA水平的檢測 使用Trizol試劑提取培養結束時H1299細胞的總RNA。實時PCR分析使用SYBR?PrimeScript?PLUS RT-RNA PCR試劑盒，使用2-ΔΔCt方法計算TAZ的總倍數變化。應用ABI7500實時PCR檢測系統，QRT-PCR在95℃進行15 s，然后在95℃進行5 s，在60℃進行34 s，共40個循環。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。所用的引物序列如下，TAZ正向：5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，TAZ反向：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'；U6正向：5'-ATGCGAGTTGTTCTCCGTCT-3'，U6反向：5'-TATCTGCGGTTTCCTCAAGC-3'。

1.8細胞TAZ蛋白水平的檢測 在含有新鮮蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中裂解細胞。蛋白質通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到聚偏氟乙烯膜上。將膜在5%脫脂奶中封閉，并加入抗TAZ抗體(1∶1000稀釋)，抗GAPDH抗體(1∶2000稀釋)，在4℃下孵育過夜。GAPDH用作內源對照。然后加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶1000稀釋)，在室溫下孵育2 h，使用增強的化學發光檢測試劑對蛋白印跡進行顯影，并使用Molecular Imager系統進行掃描。通過數字圖像分析系統(Image Pro Plus版本6.0)對圖像進行定量分析。進行3次重復實驗。

2 結果

2.1OD值和存活率比較 與H1299細胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯合組的OD值和存活率明顯降低(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯合組的OD值和存活率明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組肺腺癌H1299細胞的OD值和存活率比較

注：與H1299細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05；與靈芝孢子提取物組比較，eP<0.05

2.2細胞克隆形成數目比較 H1299細胞組、順鉑組、靈芝孢子提取物組和聯合組的細胞克隆形成數目分別為(1698.49±213.32)個、(654.36±98.36)個、(642.32±59.69)個和(263.36±54.65)個。與H1299細胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯合組的細胞克隆形成數目明顯降低(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯合組的細胞克隆形成數目明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 4組肺腺癌H1299細胞克隆形成數目(結晶紫染色 ×200)

A.H1299細胞組；B.順鉑組；C.靈芝孢子提取物組；D.聯合組

2.3細胞凋亡率比較 H1299細胞組、順鉑組、靈芝孢子提取物組和聯合組的細胞克隆形成數目分別為(0.84±0.54)%、(2.56±0.65)%、(2.34±0.63)%和(5.47±0.54)%。與H1299細胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯合組的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯合組的細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。

2.4細胞侵襲遷移能力比較 與H1299細胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯合組的穿膜細胞數和遷移率明顯降低(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯合組穿膜細胞數和遷移率明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

2.5TAZ mRNA和蛋白表達水平比較 與H1299細胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯合組TAZ mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯合組TAZ mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表3、圖3。

表2 4組肺腺癌H1299細胞侵襲遷移能力的比較

注：與H1299細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05；與靈芝孢子提取物組比較，eP<0.05

圖2 4組肺腺癌H1299細胞的穿膜細胞數(結晶紫染色 ×200)

A.H1299細胞組；B.順鉑組；C.靈芝孢子提取物組；D.聯合組

表3 4組肺腺癌H1299細胞TAZ mRNA和蛋白表達水平比較

注：TAZ為具有PDZ結合域的轉錄共激活因子；與H1299細胞組比較，aP<0.05；與順鉑組比較，cP<0.05；與靈芝孢子提取物組比較，eP<0.05

圖3 4組肺腺癌H1299細胞TAZ蛋白表達水平

A.H1299細胞組；B.順鉑組；C.靈芝孢子提取物組；D.聯合組；TAZ為具有PDZ結合域的轉錄共激活因子

3 討論

在晚期NSCLC患者中常單獨使用鉑類化療或與其他藥物聯合使用作為第一線療法，但對順鉑的耐藥性仍然是主要的臨床問題。目前，對順鉑耐藥的機制尚不完全清楚，但研究認為其本質上是多因素的，包括DNA結合不足，解毒和DNA修復增加，轉運蛋白表達失調，以及涉及細胞死亡途徑的基因(例如p53、Bcl-2和AKT/mTOR)表達和活化改變。在上述途徑中，AKT/mTOR途徑的激活在順鉑耐藥性中起重要作用。靈芝孢子提取物具有多種功能，如阻止組胺釋放和抑制過度激活的免疫系統，并具有調節細胞和體液免疫的作用。靈芝孢子提取物具有多種有效成分，包括多糖、三萜、生物堿、酶和蛋白質[10]。有研究人員發現，來自靈芝的三萜類化合物抑制了脂多糖-刺激小鼠RAW264.7細胞分泌的腫瘤壞死因子-α、白介素-6、炎性一氧化氮和前列腺素E2。此外靈芝孢子提取物對肝癌、肺癌均有明顯的抑制作用[11-12]。本研究結果發現，與H1299細胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯合組的OD值、存活率、細胞克隆形成數目、侵襲遷移能力均明顯降低，凋亡率明顯升高；與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯合組的OD值、存活率、細胞克隆形成數目、侵襲遷移能力均明顯降低，凋亡率明顯升高。該結果與上述討論一致，同時說明靈芝孢子提取物能明顯抑制肺腺癌H1299細胞的增殖、侵襲，并促進其凋亡；而當靈芝孢子提取物與順鉑聯合使用時，順鉑的抗腫瘤作用更強，這提示靈芝孢子提取物對肺腺癌H1299細胞順鉑化療具有增敏作用。

越來越多的證據表明，TAZ是肺癌的致癌基因，對肺癌的發生和轉移具有重要作用。臨床肺癌研究報告顯示，TAZ在60%以上的NSCLC中過表達，其表達與腺癌分化不良、轉移、不良預后和生存密切相關[13]。此外，TAZ可增強口腔鱗狀細胞癌、尿路上皮細胞癌和卵巢癌對順鉑的耐藥性[14]。最近多項研究均表明，TAZ的上調可以增強對多種細胞毒性劑的抗性，如人乳腺癌細胞可通過TAZ-TEAD-Cyr61/CTGF信號通路對紫杉醇產生抗性；基因表達譜研究將TAZ鑒定為原發性乳腺癌干細胞系活化、致瘤、轉移的中心介體[15-16]。順鉑耐藥的口腔鱗癌細胞核TAZ表達量明顯高于非順鉑耐藥的口腔鱗癌細胞。此外，TAZ敲低還能通過增加DNA損傷和細胞凋亡使尿路上皮癌細胞對化療和放射治療的敏感性增加；TAZ信號可能通過增加細胞自噬通量來調節卵巢癌細胞中的順鉑耐藥性[17-18]。本研究結果顯示，與H1299細胞組比較，順鉑組、靈芝孢子提取物組、聯合組的TAZ mRNA和蛋白表達明顯降低，與順鉑組和靈芝孢子提取物組比較，聯合組的TAZ mRNA和蛋白表達明顯降低。這說明順鉑或靈芝孢子提取物單獨作用時，均能明顯抑制H1299細胞的TAZ mRNA和蛋白表達；而順鉑聯合靈芝孢子提取物治療對H1299細胞TAZ mRNA和蛋白表達的抑制更加強烈。提示靈芝孢子提取物能增強順鉑對H1299細胞TAZ mRNA和蛋白表達的抑制作用。

綜上所述，靈芝孢子提取物對肺腺癌H1299細胞順鉑化療具有增敏作用；其機制與靈芝孢子提取物能增強順鉑對H1299細胞TAZ mRNA和蛋白表達的抑制有關。