延胡索甲素調節NMDAR/NF-κB介導的信號通路對利血平誘導纖維肌痛大鼠的作用及機制研究

張振武，黃紹農，凌地洋，韓 健，吳呈祥

纖維肌痛又稱纖維肌痛綜合征，屬于風濕病，是一種難治性局部疼痛綜合征，以彌漫性壓痛和疲勞為主要特征，同時對患者造成心理困擾，嚴重影響患者的生活質量。根據美國風濕病學會報道，全世界有2%～22%的人口出現纖維肌痛癥狀，其中女性患者居多[1-6]。纖維肌痛的病因復雜，目前在臨床上尚沒有系統的診療方案[7-8]。N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)是谷氨酸偶聯離子通道，近年來有研究表明，NMDAR持續激活，進而導致神經元活化閾值降低、興奮性增高和神經毒性，NMDAR主要由NR1和NR2亞基組成，而腦組織中分布的NMDAR主要為NR1和NR2B亞基[9-12]。核因子-κB(NF-κB)蛋白可以選擇性地結合B細胞κ-輕鏈增強子上調控許多基因的表達，能夠參與細胞對外界刺激的響應，NF-κB的錯誤調節會引發自身免疫病、慢性炎癥以及多種癌癥。近年來有研究表明，NF-κB/P65與纖維肌痛的發病機制密切相關[13-16]。延胡索甲素是從傳統中藥材延胡索的塊莖中提取分離得到的一種化合物。目前相關研究均認為，延胡索甲素具有很好的鎮痛作用，且其產生的中樞抑制等不良反應較小，使用安全方便[6-9]。但延胡索甲素對纖維肌痛的作用未見明確報道，本文通過研究延胡索甲素對利血平誘導纖維肌痛大鼠的作用及機制，為延胡索甲素在纖維肌痛中的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 選取SPF級健康雄性SD大鼠60只，6周齡，體重(180±20)g，購自長生生物技術有限公司，適應性飼養72 h，自由進食、飲水。延胡索甲素購自天津市永大化學試劑有限公司，NR1、NR2B、NF-κB/P65和GAPDH抗體均購自Proteintech公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，ECL顯色液購自Thermo公司，全自動生化分析儀購自北京島津醫療器械有限公司，雙垂直電泳儀、轉印電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫學產品有限公司、YLS-3E電子壓痛儀購自北京吉安得爾科技有限公司。

1.2纖維肌痛大鼠模型的建立與分組 將大鼠隨機分為對照組、模型組、延胡索甲素低、中、高劑量組，每組12只。模型組和延胡索甲素各劑量組根據大鼠體重皮下注射利血平1 mg/kg(以冰醋酸溶解，加入蒸餾水使醋酸終濃度為0.5%，現用現配)，連續3 d，每天1次[4]。對照組按照相同劑量皮下注射生理鹽水。于末次給予利血平24 h后，對各組大鼠進行稱重，記為初始體重，根據大鼠體重，對照組及模型組給予生理鹽水20 ml/kg灌胃，延胡索甲素低、中、高劑量組分別給予5、10、20 mg/ml的延胡索甲素20 ml/kg灌胃，所有組別每天定時給藥1次，連續給藥10 d，最后一次給藥24 h后，再次對大鼠進行稱重，記為最終體重，計算大鼠體重減輕值，體重減輕值=初始體重-最終體重。

1.3機械性痛閾值的測定 采用YLS-3E電子壓痛儀，將大鼠放置于透明固定器內適應10 min。分別將大鼠左、右爪放在電子壓痛儀壓頭下，于2、3跖骨間施加壓力，大鼠縮爪或是發出尖叫聲，停止加壓，記錄其壓力值。每只動物測定3次，每次間隔30 s，取3次左右爪壓力值的平均值記為機械性痛閾值。最大壓力值設置為300 g，防止損傷鼠爪。

1.4大鼠血漿炎性因子水平的測定 所有大鼠最后一次給藥24 h后，通過眼眶后靜脈叢取血至肝素潤洗過的離心管中，室溫靜置5 min，然后在4℃條件下，置于離心機以3500 r/min離心10 min。取上清液進樣至全自動生化分析儀，檢測血漿腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)及IL-1β水平。

1.5大鼠腦組織含水量檢測 每組取6只大鼠，頸椎脫臼處死后迅速分離大鼠腦組織，用生理鹽水清洗，除去血液，用濾紙吸干表面水分后稱重，記為濕重，然后置于110℃恒溫干燥箱內干燥24 h至恒重，稱重記為干重，計算各組大鼠腦組織含水量，腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6組織樣本采集與蛋白提取 每組取6只大鼠，頸椎脫臼處死后迅速分離大鼠腦組織，用生理鹽水清洗，除去血液，用濾紙吸干表面水分后，將一部分腦組織放入10%中性甲醛中固定，其余部分放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，在4℃條件下，置于離心機以12000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并加入SDS loading buffer，混勻后放入100℃水浴5 min，然后放入-20℃儲存備用。

1.7HE染色 將10%中性甲醛固定24 h的大鼠腦組織轉移至75%乙醇中，經自動組織脫水機脫水、透明處理，在石蠟包埋機中浸蠟、包埋，進行5 μm切片，水浴展開、撈片、瀝干，放入45℃恒溫箱中烘干，置于烘箱中60℃烤2 h，常規HE染色，在顯微鏡下進行組織病理學觀察。

1.8Western blot檢測 將凍存的大鼠腦組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離、轉膜，將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，加入抗體NR1、NR2B及NF-κB/P65(均1∶1000)，4℃孵育過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，凝膠成像儀成像后，應用Image J軟件進行免疫印跡灰度值檢測，Graphpad prism 5進行作圖。

2 結果

2.1延胡索甲素對纖維肌痛大鼠痛閾值的影響 對照組、模型組、延胡索甲素低、中、高劑量組痛閾值分別為(106.83±2.86)g、(74.19±2.13)g、(82.11±2.89)g、(91.36±2.25)g、(108.47±2.67)g。與對照組比較，模型組痛閾值顯著下降(P<0.05)，提示造模成功。與模型組比較，延胡索甲素低、中、高劑量組痛閾值顯著升高(P<0.05)。同時，隨著延胡索甲素劑量的增加，纖維肌痛大鼠的痛閾值也逐漸升高(P<0.05)，表現出劑量依賴性。

2.2延胡索甲素對纖維肌痛大鼠血漿炎性因子水平的影響 與對照組比較，模型組血漿TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，延胡索甲素低、中、高劑量組血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著下降(P<0.05)。同時，隨著延胡索甲素劑量的增加，纖維肌痛大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平也逐漸降低(P<0.05)，表現出劑量依賴性。見表1。

表1 5組大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

注：TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白介素-6，IL-1β為白介素-1β；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與延胡索甲素低劑量組比較，eP<0.05；與延胡索甲素中劑量組比較，gP<0.05

2.3延胡索甲素對纖維肌痛大鼠腦組織含水量和體重減輕值的影響 與對照組比較，模型組的腦組織含水量和體重減輕值均顯著升高(P<0.05)。提示纖維肌痛大鼠腦組織存在炎性水腫，并影響其飲食狀態，導致體重下降明顯。與模型組比較，延胡索甲素低、中、高劑量組的腦組織含水量和體重減輕值均顯著降低(P<0.05)。同時，隨著延胡索甲素劑量的增加，纖維肌痛大鼠的腦組織含水量和體重減輕值逐漸降低(P<0.05)，表現出劑量依賴性。見表2。

表2 5組大鼠腦組織含水量和體重減輕值比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與延胡索甲素低劑量組比較，eP<0.05；與延胡索甲素中劑量組比較，gP<0.05

2.4纖維肌痛大鼠腦組織病理學檢查結果 與對照組比較，模型組腦組織細胞間隙增大，細胞腫脹，細胞核縮小、破裂，核仁不明顯；與模型組比較，延胡索甲素高、中、低劑量組腦組織細胞破裂凋亡減少，細胞核完整，核仁清晰可見，細胞形態圓潤，細胞間隙縮小。見圖1。

圖1 5組大鼠腦組織病理學檢查結果(HE ×400)

A.對照組；B.模型組；C.延胡索甲素低劑量組；D.延胡索甲素中劑量組；E.延胡索甲素高劑量組

2.5延胡索甲素對纖維肌痛大鼠腦組織NR1、NR2B、NF-κB表達的影響 與對照組比較，模型組腦組織NR1、NR2B、NF-κB/P65表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，延胡索甲素高、中、低劑量組腦組織NR1、NR2B、NF-κB/P65表達水平顯著降低(P<0.05)，表現出劑量依賴性。見圖2。

圖2 5組大鼠腦組織NR1、NR2B、NF-κB/P65表達水平

A.對照組；B.模型組；C.延胡索甲素低劑量組；D.延胡索甲素中劑量組；E.延胡索甲素高劑量組；NF-κB為核因子-κB；與對照組比較：aP<0.05；與模型組比較：cP<0.05

3 討論

纖維肌痛是一種難治性局部疼痛綜合征，以彌漫性壓痛和疲勞為主要特征，同時伴有多種全身癥狀，包括僵硬、認知障礙、失眠、抑郁、焦慮、感覺不適、關節僵硬和胃腸道反應等，嚴重影響患者的生活質量[6]。纖維肌痛的病因復雜，主要包括遺傳易感性、外界刺激、身體創傷、年齡、性別和心理因素。目前，在臨床上治療纖維肌痛主要使用抗抑郁藥、止痛藥等進行對癥處理，尚沒有系統的診療方案[7-8]。

NMDAR持續激活能夠導致神經元活化閾值降低、興奮性增高以及神經毒性。還在神經系統發育和神經元回路形成過程中發揮著重要的生理作用。NF-κB蛋白可以選擇性地結合B細胞κ-輕鏈增強子上調控許多基因的表達。在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中NF-κB起到關鍵性作用。NF-κB的錯誤調節會引發自身免疫病、慢性炎癥以及很多癌癥。NF-κB也與突觸的可塑性、記憶有關。哺乳動物中NF-κB家族有5種蛋白，分別為：P65、RelB、c-Rel、P50和P52，而NF-κB/P65在纖維肌痛的發病過程中起到重要的作用[13-16]。

延胡索甲素是從罌粟科植物延胡索的塊莖中提取分離得到一種重要有效成分，在臨床上具有很好的鎮痛作用，作用弱于乙素及丑素，但其產生的不良反應也較小，臨床應用安全性較高。目前，延胡索甲素治療纖維肌痛的效果及作用機制研究較為少見，本文通過研究延胡索甲素對利血平誘導的纖維肌痛大鼠的作用及機制，為延胡索甲素在纖維肌痛中的臨床應用提供依據。

本文通過連續10 d給予纖維肌痛大鼠模型不同劑量的延胡索甲素灌胃后發現，與對照組比較，模型組痛閾值顯著下降；與模型組比較，延胡索甲素低、中、高劑量組痛閾值呈劑量依賴性顯著升高。提示本實驗纖維肌痛大鼠造模成功，且延胡索甲素能夠呈劑量依賴性的顯著升纖維肌痛大鼠的痛閾值，改善其病理狀態。本研究結果發現，與對照組比較，模型組血漿TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著升高；與模型組比較，延胡索甲素低、中、高劑量組血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平呈劑量依賴性顯著下降。提示延胡索甲素能夠呈劑量依賴性的降低纖維肌痛大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-1β水平，抑制其體內炎性因子的釋放，改善炎癥狀態，緩解疾病進展。本研究結果還發現，與對照組比較，模型組腦組織含水量及體重減輕值均顯著升高；與模型組比較，延胡索甲素低、中、高劑量組腦組織含水量及體重減輕值均呈劑量依賴性顯著降低。提示延胡索甲素能夠呈劑量依賴性的減輕纖維肌痛大鼠的腦組織水腫，提高其生存質量，還能明顯改善纖維肌痛大鼠的飲食及生理狀態，改善疾病轉歸。各組大鼠腦組織病理學檢查結果表明，與對照組比較，模型組大鼠腦組織細胞間隙增大，細胞腫脹，細胞核縮小、破裂，核仁不明顯；提示利血平誘導的纖維肌痛大鼠腦組織發生明顯病理性改變。與模型組比較，延胡索甲素低、中、高劑量組腦組織細胞破裂死亡減少，細胞核完整，核仁清晰可見，細胞形態圓潤，細胞間隙縮小；提示延胡索甲素能夠改善纖維肌痛大鼠腦組織病理狀態，緩解疾病進展。Western blot檢測結果表明，與對照組比較，模型組腦組織NR1、NR2B、NF-κB/P65表達水平顯著升高；提示纖維肌痛大鼠腦組織NR1、NR2B、NF-κB/P65的表達水平可能與纖維肌痛發病機制密切相關。與模型組比較，延胡索甲素高、中、低劑量組腦組織NR1、NR2B、NF-κB/P65表達水平均呈劑量依賴性顯著降低。提示延胡索甲素能夠呈劑量依賴性的顯著降低纖維肌痛大鼠腦組織NR1、NR2B、NF-κB/P65表達水平，從而抑制疼痛信號的傳導，抑制疾病的進展，緩解病理狀態，改善疾病轉歸。

綜上所述，延胡索甲素能夠改善利血平誘導纖維肌痛大鼠的疾病狀態，其機制可能與調節NMDAR/NF-κB介導的信號通路有關。