響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相提取黃秋葵多糖

何自強，張惠玲，楊正雄

（武漢生物工程學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 武漢 430415）

黃秋葵Abelmoschus esculentus，別名咖啡黃葵、秋葵、羊角豆、補腎菜等，為錦葵科Malvaceae秋葵屬Abelmoschus1年生藥食兩用草本植物。目前，全世界均有黃秋葵種植[1-3]。作為一種新型的保健蔬菜，黃秋葵中富含多糖、黃酮、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)以及脂肪等多種生物活性成分，具有較高的食用及藥用價值[4-5]。黃秋葵多糖具有抗疲勞[6]，抗氧化[7]，抗菌，抗癌[8]，降血糖血脂，提高機體免疫力及具有體外結(jié)合膽酸的能力等藥理作用[9]。同時，由于具有良好的增稠、乳化等性能，黃秋葵多糖已廣泛用于面制品、肉制品、飲料、冰淇淋等食品的生產(chǎn)中[10-12]。王煒強等[13]研究表明：黃秋葵多糖是一種天然高分子絮凝劑，安全無毒，生物降解性好，在環(huán)保領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。因此，黃秋葵多糖的開發(fā)已成為研究的熱點。超聲輔助提取可加快可溶性黃秋葵多糖的溶出，能避免高溫高壓破壞黃秋葵多糖的成分，且條件溫和、提取時間短、提取效率高[14]。離子液體通常由無機陰離子和有機陽離子組成，室溫時呈液態(tài)，離子液體不易揮發(fā)、穩(wěn)定溫度范圍寬、化學(xué)穩(wěn)定性較高、物質(zhì)溶解性良好、酸性可調(diào)[15-17]。離子液體-無機鹽雙水相萃取技術(shù)同時結(jié)合了離子液體和雙水相的優(yōu)點，具有分相時間短、無乳化現(xiàn)象、能保持生物分子活性、回收率高等優(yōu)點，是一種綠色環(huán)保的分離方法，已用于生物大分子和天然產(chǎn)物的萃取分離[18-20]。本研究首先采用濁點法分別繪制離子液體[Bmim]Cl與K2HPO4、Na2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4等4種無機鹽組成的雙水相體系相圖，篩選出[Bmim]Cl-K2HPO4為最佳體系；再利用[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相耦合超聲波提取黃秋葵多糖，通過五因素三水平響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化單因素試驗，確定黃秋葵多糖的最佳提取工藝條件，以期提高黃秋葵多糖的提取率，為黃秋葵多糖的進一步開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵果：產(chǎn)自山東微山；葡萄糖標準品：質(zhì)量分數(shù)(HPLC)≥98%，上海金穗生物科技有限公司批號20170829；1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽([Bmim]Cl)：林州市科能材料科技有限公司，分析純；三水合磷酸氫二鉀：西隴科學(xué)股份有限公司，分析純；十二水合磷酸氫二鈉：西隴科學(xué)股份有限公司，分析純；無水碳酸鈉：天津博迪化工股份有限公司，分析純；硫酸銨：國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純；苯酚、濃硫酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY120型電子天平：日本島津公司；SK3310HP超聲波清洗器(53 kHz，180 W)：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；TU-1810型紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；RE-52AAA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海嘉鵬科技有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制 精確稱取葡萄糖標準品0.020 2 g，蒸餾水溶解后于50 mL容量瓶定容、搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.404 g·L-1的葡萄糖標準溶液。精確移取0.0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL葡萄糖標準溶液至6支10 mL容量瓶中，依次加入蒸餾水1.0 mL和質(zhì)量分數(shù)為5%苯酚(蒸餾，收集182 ℃餾分)1.0 mL，振蕩搖勻后加5 mL濃硫酸，蒸餾水定容后，于92 ℃水浴中加熱30 min，流水冷卻，于487 nm波長處測其吸光度。用最小二乘法進行回歸分析，得到一元線性回歸方程：y=15.316x-0.001 9，R2=0.999 0。其中：y為吸光度，x為黃秋葵多糖質(zhì)量濃度。

1.3.2 黃秋葵多糖提取率的計算 采用苯酚-硫酸法測定黃秋葵多糖質(zhì)量。該法是先以葡萄糖作標準品做出標準曲線，再通過多糖的顯色反應(yīng)(濃硫酸可使多糖降解為葡萄糖，苯酚再與葡萄糖作用而顯色)測定吸光度，然后根據(jù)一元線性回歸方程和稀釋倍數(shù)先計算出上相液黃秋葵多糖質(zhì)量，再計算黃秋葵多糖提取率。

精確移取適量黃秋葵提取上相液于10 mL容量瓶中，其他同1.3.1，測其吸光度。黃秋葵多糖提取率=黃秋葵多糖質(zhì)量/黃秋葵粉質(zhì)量×100%

1.3.3 單因素試驗 將黃秋葵果于60 ℃下干燥4 h后，粉碎機中粉碎，過80目篩，保存?zhèn)溆谩蚀_稱取0.5 g黃秋葵粉，置于50 mL碘量瓶中，加入5 mL不同質(zhì)量分數(shù)的[Bmim]Cl溶液和5 mL不同質(zhì)量分數(shù)的K2HPO4溶液形成的雙水相體系中，將5個試驗因素K2HPO4質(zhì)量分數(shù)、提取時間、提取溫度、液固比、[Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)中的4個固定不變，1個作為變量，超聲提取后抽濾，濾液以7 500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，于分液漏斗中分相，上相液待用。

1.3.4 響應(yīng)面試驗 在5個單因素試驗得出的最佳條件基礎(chǔ)上，以單因素為自變量，黃秋葵多糖提取率為響應(yīng)值，設(shè)計五因素三水平響應(yīng)面中心組合試驗。結(jié)果見表1。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理及分析 單因素試驗數(shù)據(jù)采用2010軟件處理；響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert 8.0.6.1軟件處理，并對數(shù)據(jù)的顯著性差異進行分析。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長的確定

分別精確移取葡萄糖標準溶液0.4 mL、黃秋葵提取上相液1.0 mL于10 mL容量瓶，其他操作同1.3.1，可見光區(qū)400～800 nm光譜掃描。圖1表明：葡萄糖標準溶液和黃秋葵提取上相液在487 nm處均有最大吸收，故選擇檢測波長為487 nm。

2.2 雙水相體系的選取

2.2.1 雙水相體系分相能力的考察 采用濁點滴定法繪制各雙水相體系相圖，考察離子液體[Bmim]Cl與K2HPO4、Na2HPO4、Na2CO3、(NH4)2SO4等4種無機鹽形成雙水相體系的分相能力[21-23]。室溫20 ℃下，分別準確稱取一定質(zhì)量的無機鹽于4支試管中，加蒸餾水溶解，再加入一定質(zhì)量的[Bmim]Cl，直至溶液渾濁，膠頭滴管逐滴滴加蒸餾水至澄清，稱其質(zhì)量，反復(fù)以上操作。計算每次出現(xiàn)渾濁時，無機鹽和[Bmim]Cl的質(zhì)量分數(shù)。分別以無機鹽的質(zhì)量分數(shù)為橫坐標，[Bmim]Cl的質(zhì)量分數(shù)為縱坐標，繪制相圖。

圖2的4條曲線均為雙節(jié)線，曲線上的點為臨界點，曲線下方為單相區(qū)，不分層，曲線上方為兩相區(qū)。由圖2可知，(NH4)2SO4和Na2HPO4的分相能力較差，僅有3個濁點，繼續(xù)滴加(NH4)2SO4和Na2HPO4不再出現(xiàn)渾濁，不能與[Bmim]Cl形成穩(wěn)定的雙水相體系；Na2CO3和K2HPO4與[Bmim]Cl能形成穩(wěn)定的雙水相體系，但Na2CO3的溶解度受溫度變化影響較大，分相范圍較窄，持續(xù)時間較短，而K2HPO4分相范圍廣且持續(xù)時間較長。

2.2.2 雙水相體系萃取能力的考察 通過相比、分配系數(shù)及提取率等物理量，考察[Bmim]Cl-無機鹽雙水相體系對黃秋葵提取液的萃取能力。準確稱取一定質(zhì)量的黃秋葵粉，分別加入到5 mL一定質(zhì)量分數(shù)的4種無機鹽(Na2CO3、NaHPO4、(NH4)2SO4、K2HPO4)溶液和5 mL一定質(zhì)量分數(shù)的[Bmim]Cl形成的雙水相體系中，60 ℃水浴中超聲提取(超聲功率180 W)30 min，抽濾，濾液離心后，在分液漏斗中分相。測定上相和下相中黃秋葵多糖的吸光度，計算4種雙水相體系的相比(R)、分配系數(shù)(K)及提取率。

圖1 最大波長的確定Figure 1 Determination of maximum wavelength

圖2 雙水相體系相圖Figure 2 Phase diagram of two-phase aqueous system

式(1)～(2)中：Vt、Vb分別為上相、下相溶液體積(mL)；Ct、Cb分別為上相、下相中黃秋葵多糖質(zhì)量濃度(g·L-1)。

由表2可知：在[Bmim]Cl-(NH4)2SO4和[Bmim]Cl-Na2HPO4雙水相中，提取液不分相；[Bmim]Cl-Na2CO3和[Bmim]Cl-K2HPO4中，提取液分相，但相較而言，[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相提取率較大，且黃秋葵多糖主要分布在上相。綜合以上分析，[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相有較強的分相能力與萃取能力，因此，選擇[Bmim]Cl-K2HPO4為本試驗的雙水相體系。

表2 不同[Bmim]Cl-無機鹽雙水相體系萃取能力的比較Table 2 Comparison of extraction ability of different [Bmim]-Clinorgnic salts in aqueous two-phase system

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 K2HPO4質(zhì)量分數(shù)對黃秋葵多糖提取率的影響 稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質(zhì)量分數(shù)為70%的[Bmim]Cl溶液、液固比20 mL·g-1、提取溫度60 ℃、提取時間30 min，5 mL K2HPO4質(zhì)量分數(shù)分別為20%、21%、23%、25%、27%的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖3可知：隨著K2HPO4質(zhì)量分數(shù)的增大，黃秋葵多糖提取率先增大后減小，質(zhì)量分數(shù)23%時最大。隨著鹽量的增加，富集鹽的下相結(jié)構(gòu)性逐漸增強，容納黃秋葵多糖的空腔形成越困難，而富集離子液體的上相結(jié)構(gòu)性逐漸減弱，容納黃秋葵多糖的空腔越易形成，黃秋葵多糖提取率不斷增大；但質(zhì)量分數(shù)超過23%時，產(chǎn)生鹽效應(yīng)，黃秋葵多糖提取率逐漸降低。因此，選取23%為K2HPO4適宜的質(zhì)量分數(shù)。

2.3.2 提取時間對黃秋葵多糖提取率的影響

稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質(zhì)量分數(shù)為70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL質(zhì)量分數(shù)為23%的K2HPO4溶液，液固比20 mL·g-1，提取溫度60 ℃，分別在20、30、40、50、60 min的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖4可知：隨提取時間增長，黃秋葵多糖提取率增大，30 min時達到最大，但30 min后提取率下降，并趨于平緩。提取時間增長，上相液黏度增大，導(dǎo)致黃秋葵多糖的提取越困難。因此，選取30 min為適宜的提取時間。

圖3 K2HPO4質(zhì)量分數(shù)對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 3 Effect of K2HPO4 mass fraction on the extraction rate of okra polysaccharide

2.3.3 提取溫度對黃秋葵多糖提取率的影響 稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質(zhì)量分數(shù)為70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL質(zhì)量分數(shù)為23%的K2HPO4溶液，液固比20 mL·g-1，提取時間30 min，提取溫度分別為30、40、50、60、70 ℃的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖5可知：溫度升高，促進了黃秋葵多糖的溶出，提取率增大；但溫度過高，雜質(zhì)溶出相應(yīng)增多，提取率反而下降。因此，選取60 ℃為適宜的提取溫度。

圖4 提取時間對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 4 Effect of extraction time on the extraction rate of okra polysaccharide

圖5 提取溫度對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of okra polysaccharide

2.3.4 液固比對黃秋葵多糖提取率的影響 稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質(zhì)量分數(shù)為70%的[Bmim]Cl溶液，5 mL質(zhì)量分數(shù)為23%的K2HPO4溶液，提取時間30 min，提取溫度60 ℃，液固比分別為17、20、25、30、34、50 mL·g-1的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖6可知：隨著液固比的增大，黃秋葵粉與[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相接觸面積增加，黃秋葵多糖不斷溶出。液固比超過20 mL·g-1，黃秋葵多糖提取率下降，可能液固比過大，濃縮等操作時間延長，導(dǎo)致黃秋葵多糖損失較多，提取率下降[24]。因此，選取20 mL·g-1為適宜的液固比。

2.3.5 [Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)對黃秋葵多糖提取率的影響 稱取0.5 g黃秋葵粉于50 mL碘量瓶中，在5 mL質(zhì)量分數(shù)為23%的K2HPO4溶液，提取時間30 min，提取溫度60 ℃，液固比20 mL·g-1，[Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)分別為65.0%、67.5%、70.0%、72.5%、75.0%的條件下進行超聲提取(超聲功率180 W)。由圖7可知：隨著[Bmim]Cl量的增大，黃秋葵多糖在上相的富集增多，[Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)72.5%時最大，之后提取率下降，黃秋葵多糖在上相的富集達到飽和。因此，選取72.5%為[Bmim]Cl適宜的質(zhì)量分數(shù)。

圖6 液固比對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 6 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of okra polysaccharide

圖7 [Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)對黃秋葵多糖提取率的影響Figure 7 Effect of [Bmim]Cl mass fraction on the extraction rate of okra polysaccharide

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

五因素三水平響應(yīng)面試驗共46組，包括析因試驗(40組)和中心試驗(6組)。析因試驗各不相同，6組因素水平均相同的中心試驗，是重復(fù)6次以估算試驗誤差。

對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到各單因素與黃秋葵多糖間的二次多元方程：y=27.27-0.13A+0.17B-0.35C+2.99D-1.26E+2.62AB-0.063AC-1.14AD+0.64AE+3.29BC+2.06BD+0.95BE-3.77CD+0.98CE+0.21DE-3.68A2-5.53B2-2.75C2-3.04D2-4.85E2。

分析表3數(shù)據(jù)可知：模型P＜0.000 1(差異極顯著)，模型對黃秋葵多糖的提取有顯著影響，失擬項P=0.909 7＞0.050 0(差異不顯著)，說明模型擬合程度較好；各單因素與黃秋葵多糖提取率之間呈良好線性關(guān)系(R2=0.974 2)，模型能解釋95.35%的黃秋葵多糖提取率的變化；變異系數(shù)為4.31%，數(shù)據(jù)分散程度較小，試驗結(jié)果可信，因此該模型可分析和預(yù)測黃秋葵多糖的提取結(jié)果。由F值大小可推斷5個單因素對黃秋葵多糖提取率顯著性影響的順序：D(液固比)＞E([Bmim]Cl 質(zhì)量分數(shù))＞C(提取溫度)＞B(提取時間)＞A(K2HPO4質(zhì)量分數(shù))；由P值大小可推斷：一次項中，D、E對提取率影響極顯著；二次項中，A、B、C、D、E對提取率影響均極顯著；交互項中，AB、BC、BD、CD之間作用對提取率的影響極顯著，AD、BE、CE之間作用對提取率的影響顯著。圖8為各因素交互作用對黃秋葵多糖提取率顯著影響的響應(yīng)面圖。

通過回歸模型可預(yù)測黃秋葵多糖提取的最佳工藝條件為：K2HPO4質(zhì)量分數(shù)22.31%，提取時間29.36 min，提取溫度55.69 ℃，液固比25.00 mL·g-1，離子液體[Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)71.94%。在此條件下，黃秋葵多糖提取率可達29.12%。

2.5 驗證試驗

為實際操作方便，在K2HPO4質(zhì)量分數(shù)22%，提取時間29 min，提取溫度56 ℃，液固比25.00 mL·g-1，離子液體[Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)72%的條件下進行驗證試驗。5次平行試驗的黃秋葵多糖提取率為：30.28%、32.48%、30.24%、32.47%、30.64%，平均值為31.22%，相對標準偏差為3.70%。

3 結(jié)論

室溫下分別繪制離子液體[Bmim]Cl與4種無機鹽[(NH4)2SO4、Na2HPO4、Na2CO3和K2HPO4]形成的雙水相體系相圖，通過比較提取后黃秋葵多糖在各體系中的相比、分配系數(shù)和提取率，確定[Bmim]Cl-K2HPO4為本實驗的雙水相體系。離子液體-無機鹽雙水相體系對環(huán)境無污染，是一種新型綠色的分析方法。

選取5個因素：K2HPO4質(zhì)量分數(shù)、提取時間、提取溫度、液固比和離子液體[Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)進行單因素試驗，以單因素最佳提取條件為基礎(chǔ)進行響應(yīng)面試驗，超聲波輔助[Bmim]Cl-K2HPO4雙水相提取黃秋葵多糖的最佳工藝可由回歸模型預(yù)測。在5 mL離子液體[Bmim]Cl質(zhì)量分數(shù)為71.94%，5 mL K2HPO4質(zhì)量分數(shù)為22.31%的雙水相體系中，提取時間為29.36 min，提取溫度為55.69 ℃，液固比為25.00 mL·g-1的最佳提取條件下，黃秋葵多糖的提取率為29.12%。在該預(yù)測最佳工藝基礎(chǔ)上進行5次驗證試驗，黃秋葵多糖提取率平均值為31.22%，相對標準偏差為3.70%。

圖8 各因素交互作用對黃秋葵多糖提取率交互影響的響應(yīng)面圖Figure 8 Response surface of the interaction of various factors on the extraction rate of polysaccharides from okra