硫酸鹽對微生物催化石門雄黃尾礦土壤中砷溶解與釋放的影響

吳薇薇，陳曉明,曾憲春

(中國地質大學(武漢)環境學院，湖北 武漢 430074)

砷(As)是一種高毒性的非金屬元素，以有機或無機形式廣泛分布于環境中。自然狀態下砷有4種價態：-3、0、+3和+5[1]。砷污染的土壤和水中砷最主要是無機態的亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]和砷酸鹽[As(Ⅴ)]，其中亞砷酸鹽比砷酸鹽具有更強的流動性和毒性。砷化合物已被歸為人類致癌物質，高劑量急性砷暴露可能會導致人發生嚴重的砷中毒甚至死亡，低劑量砷慢性接觸可導致人的各種器官和組織產生癌變，也可導致出現角化過度、黃疸、神經病變、糖尿病、心血管疾病、中風、肺病、肝毒性和其他嚴重疾病[2-3]。據世界衛生組織(WHO)公布，對公共衛生最大的威脅來自受砷污染的地下水。通過作物灌溉和糧食生產中使用高砷地下水或直接飲用受砷污染的地下水使人類暴露于高濃度砷的環境中[3-4]。中國大約有1 960萬人受到砷污染地下水的威脅[5]。許多研究表明，地下水中的砷在土壤、沉積物和巖石中主要以砷酸鹽的形式存在[6]。

微生物在砷從不溶相中釋放到地下水中起著關鍵的作用[5,7-9]。越來越多的證據表明，呼吸性砷還原菌(DARPs)是砷從不溶相中溶解和釋放到地下水中的主要驅動力[10-11]。使用各種有機物，如乳酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽和芳香化合物，或無機物，如硫化物和氫氣，作為電子供體[12-14]，DARPs可以在厭氧條件下將As(Ⅴ)轉化為As(Ⅲ)。呼吸性砷還原酶是位于細胞周質中與細胞相連的砷代謝酶，這使得細菌可以從固相中還原As(Ⅴ)，從而溶解與釋放到地下水中?？梢?，從砷污染土壤、沉積物和尾礦中分離出的可培養的DARP，包括Desulfuromonassp.WB3[15]，Bacilussp.M17-15[16]和Aeromonassp.JH155[8]，能夠直接還原吸附砷酸鹽或礦物質，并顯著增強不溶性砷的溶解與釋放。但是，這些研究忽略了一個問題：環境因素如何影響微生物介導的土壤中砷從不溶相向地下水中釋放。因此，本文從一處有砷污染歷史的地區——湖南石門雄黃礦區采集尾礦土壤樣品，利用厭氧操作技術、分子生物學技術等探究了硫酸鹽如何影響微生物介導的尾礦土壤中砷的溶解與釋放。

1 材料與方法

1.1 尾礦土壤樣品采集與分析

圖1 石門雄黃礦區尾礦土壤樣品TIB的采樣點Fig.1 Sampling site of the soil samples named as TIB in the Shimen Realgar Mine area

1.2 硫酸鹽對呼吸性砷還原菌(DARPs)介導的尾礦土壤中砷和鐵溶解與釋放的影響試驗

為了探究硫酸鹽對砷釋放的影響，將3.0 g尾礦土壤樣品與10.0 mL無氧改良礦物鹽培養基混合，補充10.0 mM乳酸鹽和10.0 mM硫酸鹽或不補充硫酸鹽。將3.0 g尾礦土壤樣品與相同的培養基混合而不添加乳酸鹽和硫酸鹽來制備對照，所有操作均在厭氧手套箱中進行。將所有混合物樣品在30℃、厭氧條件下振蕩培養，分別在第0 d、4 d、8 d、14 d、21 d、28 d取出約0.5 mL懸浮液用于測量可溶性砷和鐵以及乳酸鹽、硫酸根的含量。所有處理一式3份，改良礦物鹽培養基成分為：3.0 g KH2PO4、3.0 g Na2HPO4、1.0 g NH4Cl、0.5 g KCl、0.01g CaCl2、10.0 mL維生素溶液、5.0 mL微量元素溶液，加去離子水至1 000.0 mL，調節pH值至7.0～7.2。

1.3 基于qPCR技術的arrA基因豐度的分析

實時熒光定量PCR (Real-time Quantitative PCR Detecting System) 技術通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，并結合相應的軟件對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。本次試驗目的是檢測細菌中呼吸性砷還原酶基因(arrA)的濃度[20]。使用土壤DNA提取試劑盒，從培養21 d的混合物樣品中提取微生物群落總DNA，將含arrA基因的質粒標準品連續稀釋制備標準曲線，用于定量PCR(qPCR)分析。使用引物arrA-CVF1(5′-CGAAGTTCGTCCCGATHACNTGG-3′)和arrA-CVR1(5′-GGGGTGCGGTCYTTNARYTC-3′)[21]，所有qPCR均使用SYBR Premi Ex Taq Ⅱ試劑盒(TaKaRa,Japan)和StepOnePlus Real-Time PCR系統(Applied Biosystems，USA)。arrA基因的PCR循環包括94℃預變性5 min，然后進行35個循環：94℃變性30 s，55℃退火30 s和72℃延伸1 min。

1.4 尾礦土壤微生物群落結構分析

使用E.Z.N.A土壤DNA提取試劑盒(Omega，USA)提取尾礦土壤微生物基因組DNA。如前所述[22]，使用微生物16S rRNA基因引物338F(5′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)以及IlluminaMiSeq測序平臺對尾礦土壤微生物16S rRNA基因進行PCR擴增和測序[15]。環境微生物多樣性檢測服務由上海美吉生物科技有限公司提供。

2 結果與分析

2.1 尾礦土壤的地球化學特征分析

石門雄黃礦區尾礦土壤樣品TIB的地球化學特征分析結果，見表1。

表1 石門雄黃礦區尾礦土壤樣品TIB的地球化學特征Table 1 Geochemistry features of the soil sample named as TIB in the Shimen Realgar Mine area

2.2 硫酸鹽對呼吸性砷還原菌(DARPs)介導的尾礦土壤中砷和鐵溶解與釋放的影響

2.2.1 硫酸鹽對微生物催化的尾礦土壤中過程中可溶性As(Ⅲ)和Fe(Ⅱ)釋放含量變化的影響

為了探究硫酸鹽對DARPs催化的尾礦土壤中砷和鐵溶解與釋放的影響,本次設計了6組試驗：滅菌土、滅菌土加乳酸鹽、滅菌土加乳酸鹽和硫酸鹽、活性土、活性土加乳酸鹽、活性土加乳酸鹽和硫酸鹽，其中對照組中滅菌土是由湖北省農業科學院農產品加工與核技術研究所鈷-60輻射滅菌，考察了硫酸鹽對DARPs催化的尾礦土壤中可溶性As(Ⅲ)和Fe(Ⅱ)釋放含量變化的影響，其試驗結果見圖2。

圖2 微生物催化從尾礦土壤樣品T1B中釋放的可溶性As(Ⅲ)和Fe(Ⅱ)含量變化Fig.2 Content of microbial release of As(Ⅲ) and Fe(Ⅱ) from the tailings soil sample T1B

由圖2可見，滅菌土試驗組中，滅菌土是否添加乳酸鹽、硫酸鹽對可溶性As(Ⅲ)、Fe(Ⅲ)釋放含量變化的影響不明顯，說明乳酸鹽和硫酸鹽對滅菌土中砷、鐵溶解與釋放的影響較?。幌啾戎?，活性土試驗組中，可溶性As(Ⅲ)和Fe(Ⅲ)釋放含量有少量增加，培養21 d后可溶性As(Ⅲ)和Fe(Ⅲ)分別有4.83 μM、0.83 μM的釋放量，而活性土添加10.0 mM乳酸鹽試驗組，在無光培養21 d時可溶性As(Ⅲ)和Fe(Ⅲ)分別有47.98 μM、3.83 μM的釋放量，比較發現添加乳酸鹽厭氧培養至第21 d后可溶性As(Ⅲ)和Fe(Ⅲ)的釋放量分別增加了892.55%、504.82%，這表明DARPs利用了乳酸鹽作為唯一的電子供體，顯著催化了尾礦土壤樣品T1B中砷、鐵的溶解與釋放。

為了分析硫酸鹽對DARPs催化尾礦土壤中砷和鐵釋放的影響，試驗設計活性土添加10.0 mM乳酸鹽和10.0 mM硫酸鹽，在培養8 d、14 d、21 d時，分別釋放了15.93 μM、43.30 μM、136.74 μM的砷，7.16 μM、13.06 μM、20.06 μM的鐵，將其與活性土不添加硫酸鹽試驗組進行對比發現，砷的釋放量在第8 d、14 d、21 d分別增加了160.67%、22.71%、184.96%，鐵的釋放量分別增加了574.37%、547.04%、423.35%，且單獨檢測發現釋放的砷、鐵均為可溶性As(Ⅲ)、Fe(Ⅱ)。上述結果表明：硫酸鹽顯著增強了尾礦土壤中DARPs催化的不可溶性砷、鐵的溶解與釋放。

由圖2(a)可見，硫酸鹽對微生物介導的尾礦土壤中砷溶解與釋放的刺激作用隨著時間的推移而減弱，這可能歸因于尾礦土壤中硫酸鹽還原菌(SRB)的影響，雖然未能使用PCR技術檢測尾礦土壤中SRB的存在，但后續試驗檢測到硫化物的增加表明它可能存在。硫酸鹽是SRB的底物，可能激活SRB的增殖，SRB可以將硫酸鹽轉化為硫化物，沉淀As(Ⅲ)并限制砷從土壤相中溶解與釋放到地下水中[23]。

2.2.2 硫酸鹽對微生物催化的尾礦土壤中其他物質含量變化的影響

為了探究硫酸鹽促進微生物介導的砷和鐵釋放過程中其他物質含量的變化，本試驗設計在第0 d和第21 d分別檢測添加硫酸鹽試驗組中乳酸鹽和硫酸鹽含量的變化，其試驗結果見圖3。

圖3 微生物反應過程中尾礦土壤樣品T1B中乳酸鹽和硫酸鹽含量的變化Fig.3 Fate of lactate and sulphate in the tailings soil sample T1B during the microbial reactions

由圖3可見，滅菌土中添加的乳酸鹽含量減少了0.21 mM，不排除試驗誤差造成的變化；而活性土中，乳酸鹽含量減少了4.80 mM，這說明尾礦土壤樣品T1B中微生物群落在促進了砷和鐵釋放的同時消耗了4.80 mM的乳酸鹽[見圖3(a)]；檢測添加硫酸鹽試驗組中添加的10.0 mM硫酸鹽含量的變化，發現除去土壤混合液中自身的硫酸鹽和硫化物外，還通過微生物作用產生了1.83 mM硫化物，硫酸鹽含量減少了4.91 mM，這表明尾礦土壤樣品T1B中細菌可利用硫酸鹽，將硫酸鹽還原為亞硫酸鹽，再進一步還原為硫化物[見圖3(b)]。

綜上所述，石門雄黃礦區尾礦土壤樣品T1B中存在能夠利用乳酸鹽作為唯一的電子供體，將尾礦土壤中不可溶性As(Ⅴ) 轉化為可溶性As(Ⅲ)的DARPs,在這些微生物利用乳酸鹽催化尾礦土壤中砷、鐵溶解與釋放的同時，硫酸鹽作為影響因子顯著促進了尾礦土壤中砷和鐵的釋放；體系中硫化物的含量增加、硫酸鹽的含量減少，說明尾礦土壤樣品T1B中微生物能夠還原硫酸鹽，產生硫化物。

2.3 硫酸鹽促進呼吸性砷還原酶基因的表達

為了進一步了解硫酸鹽是否通過促進呼吸性砷還原酶的活性，從而促進尾礦土壤樣品T1B中微生物催化的砷和鐵釋放到水相中，本試驗利用qPCR 技術，測定DARPs中arrA基因的豐度。厭氧培養21 d后，提取添加或者不添加10.0 mM硫酸鹽兩個試驗組的DNA，檢測arrA基因的豐度，其試驗結果見圖4。

圖4 硫酸鹽對尾礦土壤樣品T1B中arrA基因拷貝數的影響Fig.4 Effect of sulphate on the copy number of arrA gene in the tailings soil sample T1B

由圖4可見，添加乳酸鹽試驗組尾礦土壤中arrA基因拷貝數為4.83×105/g尾礦土，添加乳酸鹽和硫酸鹽試驗組尾礦土壤中arrA基因拷貝數為12.37×105/g尾礦土，同比添加硫酸鹽試驗組arrA基因豐度增加了156.14%。

由此可見，在T1B點位尾礦土壤中存在大量DARPs，它們可利用乳酸鹽作為唯一電子供體生長，活性土添加硫酸鹽后，呼吸性砷還原酶的豐度明顯增加，表明硫酸鹽刺激了DARPs的增殖，促進了呼吸性砷還原酶的活性，這些DARPs通過酶活性增強，加強了砷從不可溶性As(Ⅴ)還原為可溶性As(Ⅲ) 的作用，從而催化了砷從不可溶性轉為可溶性釋放到地下水中。

2.4 尾礦土壤中微生物群落結構分析

為了更好地理解本研究觀察的微生物基礎，試驗利用高通量配對末端測序技術分析了尾礦土壤樣品T1B中微生物群落的結構,其試驗結果見圖5。

圖5 石門雄黃礦區尾礦土壤樣品T1B中門分類水平的微生物群落組成分析Fig.5 Analysis of the microbial community compositions in the tailings soil sample T1B in Shimen Realgar Mine at phylum level

由圖5可見，在T1B點位尾礦土壤中在門分類水平上主要有18個細菌門，微生物群落主要以Proteobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Actinobacteria這四個群落為主要門類，其占比分別為28.55%、23.27%、21.35%、11.41%，還有Microgenomates(0.14%)、Planctomycetes(0.28%)、Bacteroidetes(0.54%)、Nitrospirae(0.83%)、unclassified-k-norank(2.05%)、Saccharbacteria(2.15%)、Acidobacteria(4.18%)、Chloroflexi(4.95%)和其他豐富程度較低的微生物，如Tenericutes(0.02%)、Fusobacteria(0.05%)、Chlorobi(0.03%)、Parcubacteria(0.03%)、Tenericutes(0.02%)、Deinococcus-Thermus(0.03%)、Gemmatimonadetes(0.09%)；尾礦土壤樣品T1B中Proteobacteria和Firmicutes是富砷尾礦土壤中常見的主要的門類，同時也是DARPs主要存在的門類，而Cyanobacteria和Actinobacteria這兩個門類在富砷尾礦土壤中作為主要微生物較為少見，由此可見石門雄黃礦區尾礦土壤樣品T1B中的微生物多樣性較為獨特。

3 結論與討論

石門雄黃礦區及其周邊的地下水長期受到砷的污染，研究表明硫酸鹽顯著地促進了微生物群落催化的砷污染土壤中砷和鐵的溶解與釋放。此外，研究乳酸鹽和硫酸鹽的去向表明，在微生物反應過程中，乳酸鹽被氧化成乙酸，硫酸鹽被還原為硫化物。功能基因豐度的定量PCR分析表明，這種現象歸因于硫酸鹽引起的呼吸性砷還原酶基因豐度的顯著增強。呼吸性砷還原菌(DARPs)將硫酸鹽還原成亞硫酸鹽再到硫化物，同時顯著促進了呼吸性砷還原酶arrA基因的豐度。本研究的發現為尾礦土壤中砷、鐵、硫的生物地球化學反應提供了新的見解，這一發現驗證了Wang等[9]關于地下水中砷含量動態變化機制的結論。

硫酸鹽肥料可為植物生長提供必需的硫營養素。據估計，2015年全球硫酸鹽肥料產量為690億t，到2029年將增加到720億t[24-25]。這表明農業施肥顯著增加了土壤中硫酸鹽的含量，且農業殘留物的微生物分解也會產生大量的硫酸鹽。然而，研究發現硫酸鹽可以顯著增強DARPs催化的砷還原、溶解與釋放，這表明農業活動可能會加劇地下水中砷污染。本研究為將農業活動與地下水中砷污染聯系提供了證據，建議在砷污染的土壤和地下水的生物修復中使用硫酸鹽須慎重考慮。