黃芪多糖對糖尿病心肌病大鼠心肌細胞凋亡的影響

(青島大學附屬醫院老年醫學科，山東 青島 266003)

糖尿病心肌病(DCM)是由糖尿病引起的心肌特異性病變，是糖尿病病人致殘致死的主要原因[1]。

DCM的病理機制錯綜復雜，包括代謝紊亂、慢性低度炎癥、微血管結構及功能障礙、自主神經功能紊亂、氧化應激、線粒體功能障礙等[2]。研究表明，心肌細胞凋亡增加在DCM的發生發展中起重要的作用[3]。自噬是指通過溶酶體途徑選擇性降解細胞組分，繼而實現細胞自身代謝需要及循環更新胞質成分的過程，在某些情況下，自噬激活被認為具有心臟保護作用[4]。有研究表明，通過促進自噬可緩解凋亡，防治DCM，提示調控自噬可能是治療DCM的有效策略[5]。黃芪多糖(APS)是黃芪的主要活性成分之一，不僅具有免疫調節、抗氧化應激、抗腫瘤、雙向調節血糖、保護心肝腎等多種藥理活性，還可改善DCM[6]。我們的前期研究表明，APS通過抑制內、外源性凋亡途徑以及內質網應激，抑制心肌細胞凋亡，改善DCM大鼠心功能[7]。近年來的研究結果表明，APS可抑制MAP4K3表達和mTOR信號的下傳，而上調自噬，通過恢復自噬通量可改善心肌細胞功能[8]。然而，APS是否可通過影響DCM大鼠心肌細胞自噬進而改善心肌細胞凋亡尚不清楚。因此，本研究用APS進行干預，探討其對DCM大鼠心肌細胞凋亡和自噬途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠30只，7～8周齡，體質量200～250 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。飼養條件：室溫(25±1)℃，濕度(50±10)%，明暗周期12 h，自由飲水和攝食。所有動物相關實驗操作均獲得青島大學動物福利和倫理管理委員會的批準。

1.1.2主要藥物及試劑 APS(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma-Aldrich)；檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mol/L，pH值4.5，索萊寶公司)；RIPA裂解液和蘇木精-伊紅染色試劑盒(碧云天公司)；LC3和p62抗體(Cell Signaling Technology，USA)；GAPDH抗體(Abcam，USA)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶公司)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Roche，USA)。

1.1.3儀器和設備 羅氏優越型血糖儀(ACCU CHEK Advantage，Roche, Germany)；Vevo?2100超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實時影像系統(VisualSonics，Canada)；電泳儀(Bio-Rad，USA)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetic，USA)；石蠟切片機(Leica RM2265)；全功能微孔板檢測儀(BIO-TEK，USA)；奧林巴斯光學顯微鏡(Olympus BX53，Japan)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組及處理 所有大鼠適應性飼養1周，禁食不禁水12 h后，隨機分為正常對照組(NC組)、DCM組和APS治療組(APS組)，每組10只。DCM組和APS組大鼠一次性腹腔注射10 g/L的STZ溶液50 mg/kg[9](注射前用0.1 mol/L、pH值4.5的檸檬酸鈉緩沖液在冰上避光配制，現配現用)以誘導1型糖尿病模型，NC組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。分別于注射后第3、7天，禁食12 h后從尾靜脈采血測空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L且伴有“三多一少”癥狀者視為造模成功。同時，參考既往研究[10]，APS組一次性灌胃給予APS溶液1 g·kg-1·d-1進行干預，而NC組和DCM組灌胃等體積的生理鹽水，連續干預16周。

1.2.2血糖和體質量監測 動物自飼養開始，于每周末同一時間稱量并記錄大鼠的體質量，在禁食12 h后經尾靜脈采血測空腹血糖。

1.2.3超聲心動圖評估心功能 實驗16周后，采用體積分數0.03異氟烷霧化吸入麻醉大鼠，由同一專業人員使用小動物超聲成像系統檢測經胸二維超聲心動圖，獲得以下心功能指標：左心室舒張末期直徑(LVEDD)、左心室收縮末期直徑(LVESD)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)、縮短分數(FS)和射血分數(EF)。重復測量6個連續的心動周期。

1.2.4心肌組織病理觀察 心功能評估結束后，腹腔注射水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠，迅速分離出心臟，用大量生理鹽水洗去其內殘留血液后，將心臟沿心室中間橫向平分，取部分左心室組織浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上，4 μm石蠟切片后，行蘇木精-伊紅、TUNEL染色，在光學顯微鏡下觀察相關病理改變。

1.2.5Western blot檢測心肌組織內p62和LC3蛋白表達 使用RIPA裂解液提取心肌組織總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度[11]。根據測試結果，將樣品濃度調至1 g/L，并加入適量4×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白轉至PVDF膜上。牛奶封閉膜2 h，以TBST洗膜3次后，加相應的一抗室溫下孵育2 h，再洗膜3次，然后加與一抗結合的二抗室溫下孵育1.5 h。以TBST洗膜3次后，使用ECL顯影劑顯影相關蛋白條帶，用Image J圖像分析軟件分析灰度值，計算p62和LC3蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀態評估

除去造模失敗、死亡及狀態不佳不合格大鼠后，每組有6只大鼠納入實驗研究及數據分析。STZ注射后，DCM組和APS組大鼠出現明顯的多飲、多尿、多食等糖尿病癥狀，DCM組大鼠體質量較NC組明顯下降，血糖較NC組明顯升高，說明模型建立成功。APS干預后，與DCM組相比，APS組大鼠體質量明顯增加，血糖明顯降低，說明APS可改善糖尿病大鼠的體質量和血糖。

2.2 各組大鼠心功能比較

與NC組相比，DCM組大鼠LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV顯著增大，EF、FS顯著下降(F=5.584～342.701，t=3.125～18.648，P<0.05)，提示其心功能下降。而APS干預可顯著減小LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV，并抑制FS的下降(t=2.503～13.416，P<0.05)，說明APS干預可一定程度改善DCM大鼠心功能。見表1。

表1 各組大鼠心功能相關參數比較

與NC組相比，F=5.584～342.701，*t=3.125～18.648，P<0.05；與DCM組相比，#t=2.503～13.416，P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌組織病理學改變

NC組大鼠心肌細胞完整，肌纖維排列有序，無凋亡及炎性細胞浸潤。DCM組大鼠心肌組織發生明顯改變，出現心肌細胞肥大和排列紊亂、肌纖維斷裂、細胞邊界不清和大小不一。APS組大鼠心肌組織排列較DCM組整齊，心肌細胞凋亡減少，炎癥較輕，說明APS可顯著改善DCM心肌組織病理改變。

2.4 APS對DCM大鼠心肌細胞凋亡影響

干預16周后，TUNEL染色結果顯示，NC組、DCM組和APS組的細胞凋亡率分別為(11.48±2.44)%、(55.84±7.84)%和(16.31±4.06)%。與DCM組相比，APS組大鼠心肌細胞凋亡率明顯下降(F=23.931，t=9.157，P<0.05)，說明APS干預可抑制DCM大鼠心肌細胞凋亡。

2.5 APS對DCM大鼠心肌組織自噬相關蛋白表達影響

干預16周后，Western blot檢測結果顯示，相較于NC組，DCM組大鼠心肌組織內LC3蛋白表達顯著降低，而p62蛋白表達顯著升高(F=11.341、22.155，t=4.439、9.409，P<0.05)，表明在DCM大鼠中心肌細胞自噬受到抑制。而與DCM組相比，APS組大鼠心肌組織內LC3蛋白表達上調，p62蛋白表達下降，差異均有統計學意義(t=3.714、9.682，P<0.05)，說明APS干預可恢復DCM大鼠心肌細胞內自噬水平，從而發揮保護作用。見表2。

組 別 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰp62/GAPDHNC組1.33±0.12 0.84±0.07 DCM組0.82±0.11*1.53±0.11*APS組1.24±0.18#0.82±0.08#

與NC組相比，F=11.341、22.155，*t=4.439、9.409，P<0.05；與DCM組相比，#t=3.714、9.682，P<0.05。

3 討 論

糖尿病引起的心血管并發癥的發病率及死亡率在全球逐年上升，并帶來高經濟負擔，值得重視[12]。其中，DCM是糖尿病病人發生心力衰竭的主要原因，然而，DCM的確切病理生理機制尚不清楚。DCM發病緩慢隱匿，早期即發生結構和功能異常，包括左心室肥大、心肌纖維化、舒張功能障礙和細胞信號傳導異常[13]。本研究結果顯示，DCM組大鼠LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV增大，EF、FS下降，表明其心功能下降；而蘇木精-伊紅染色提示DCM大鼠心肌結構發生異常改變，TUNEL染色提示心肌細胞凋亡增加。我們的前期研究顯示，APS可有效緩解DCM的心肌細胞凋亡，改善大鼠心功能[7]。本實驗APS組大鼠心臟超聲相關指標的改變進一步表明，APS可改善DCM大鼠心功能；蘇木精-伊紅及TUNEL染色表明，APS組大鼠心肌結構及心肌細胞凋亡得到有效改善。但其具體的分子機制尚不明確，有待進一步探討。

自噬是一種具有高度保守性、可選擇性地降解過多或有害胞質成分(如受損的線粒體或蛋白多聚體)的過程，對細胞起保護作用[14]。有關研究表明，在DCM中自噬不足，而上調自噬可阻礙DCM進展[15]。AMPK的激活可恢復心臟自噬，可防止心肌細胞凋亡，改善心功能[16]。在肝臟中，APS以與二甲雙胍類似的方式抑制促凋亡的內質網應激和上調受抑制的自噬，恢復肝功能[17]。此外，APS預處理可恢復因阿霉素抑制的心臟自噬，減輕心臟損傷，改善心功能[8]。LC3參與自噬體形成到成熟的各個階段，是目前研究自噬最常用的標志物，主要包括LC3-Ⅰ(胞質狀態)和LC3-Ⅱ(膜結合狀態)。當自噬發生時，LC3-Ⅰ被活化，結合磷脂酰乙醇胺轉變為LC3-Ⅱ，促進自噬體形成及成熟[14]，LC3-Ⅱ的變化水平與自噬程度呈正相關，可部分反映自噬水平。此外，在選擇性自噬中，p62作為自噬受體被特異性招募至自噬體內降解，因此也常被作為檢測自噬水平的指標。目前，采用Western blot方法檢測LC3-Ⅱ的變化及輔助性檢測p62水平是評估自噬的主要方法[18]。本文研究通過Western blot檢測表明，DCM組大鼠心肌細胞內LC3蛋白表達較NC組顯著降低，伴隨p62蛋白表達升高，表明DCM組心肌細胞自噬受到抑制；而APS干預后，與DCM組相比，APS組大鼠心肌組織內LC3蛋白表達上調，p62蛋白表達下降。提示APS可能通過自噬途徑有效減少DCM心肌細胞凋亡。

綜上所述，APS能夠有效恢復自噬活性，減輕糖尿病所致的心肌細胞凋亡。