褐藻膠寡糖對D-半乳糖誘導小鼠白內障的影響

(青島大學附屬醫院老年醫學科,山東 青島 266000)

白內障是由增齡、免疫和代謝異常、局部營養障礙、創傷等多種原因引起的晶狀體代謝紊亂，使晶狀體蛋白發生變性，最終導致晶狀體混濁。白內障是導致老年人視力障礙的主要原因之一，位居我國致盲性眼病首位[1]。目前白內障的治療仍以手術治療為主，但藥物治療同樣重要。研究發現，晶狀體上皮細胞凋亡在白內障發生和發展過程中起重要的作用[2-3]。D-半乳糖介導的嚙齒動物衰老模型已廣泛應用于衰老相關性疾病及抗衰老研究。褐藻膠寡糖(AOS)屬于海藻寡糖，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抑制凋亡等生物學活性。AOS對D-半乳糖誘導的白內障的作用鮮有報道。本實驗通過D-半乳糖誘導制備C57BL/6J小鼠白內障模型，探討AOS對D-半乳糖誘導C57BL/6J小鼠白內障的影響及其可能的作用機制,為白內障的藥物治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

C57BL/6J小鼠購于濟南鵬躍實驗動物繁育中心；AOS購于青島博智匯力生物科技有限公司；D-半乳糖、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于北京索萊寶公司；Bax兔多克隆抗體、Bcl-xl和β-actin兔單克隆抗體、caspase-3鼠單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG二抗購于武漢伊萊瑞特公司；RIPA裂解液購于上海碧云天公司。

1.2 實驗方法

1.2.1小鼠分組及處理 45只8周齡C57BL/6J雄性小鼠于青島大學實驗動物中心(SPF級)適應性飼養1周后用于實驗。實驗期間保持室內溫度18～22 ℃，相對濕度40%～60%，明/暗周期為12 h，小鼠自由進食和飲水。應用隨機數字表法將45只小鼠分為對照組(A組)、D-半乳糖組(B組)、D-半乳糖+AOS低劑量組(C組)、D-半乳糖+AOS中劑量組(D組)和D-半乳糖+AOS高劑量組(E組)，每組9只。A組小鼠于頸背部皮下注射滅菌注射用水(5 mL·kg-1·d-1)8周，其余各組小鼠均頸背部皮下注射D-半乳糖(200 mg·kg-1·d-1)8周。自實驗第5周開始，A、B兩組小鼠給予蒸餾水10 mL·kg-1·d-1灌胃處理4周，C、D、E組小鼠分別給予AOS 50、100、150 mg·kg-1·d-1灌胃處理4周。該動物實驗經青島大學動物福利和倫理管理委員會批準，且遵守《動物保護與使用指南》。

1.2.2晶狀體混濁度觀察及評分 實驗結束后，摘取小鼠眼球并在生理鹽水中清洗3次，解剖顯微鏡下分離晶狀體。根據SIPPEL[4]描述的晶狀體混濁度評分標準，將晶狀體混濁度分為0～5分。0分：晶狀體透明，無空泡；1分：晶狀體透明，空泡少于3個；2分：晶狀體透明，空泡多于3個；3分：空泡覆蓋整個晶狀體表面；4分：晶狀體部分混濁；5分：晶狀體完全混濁。

1.2.3蘇木精-伊紅染色(HE染色) 應用HE染色觀察晶狀體細胞形態變化。將摘取的眼球在生理鹽水中清洗3次，迅速置于40 g/L甲醛緩沖溶液中固定，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片后經過脫水、HE染色、透明、封片處理后，應用光學顯微鏡觀察晶狀體上皮細胞形態結構變化。

1.2.4Western blot方法檢測晶狀體Bax、Bcl-xl和caspass-3蛋白的表達 收集各組小鼠至少10個晶狀體樣本，應用4 ℃磷酸鹽緩沖液沖洗3次，濾紙吸干后稱質量，按質量體積比1∶9加入4 ℃的磷酸鹽緩沖液，于冰上經研磨棒充分研磨后，制成100 g/L的晶狀體勻漿，低溫12 000 r/min離心5 min，留取上清液。加入RIPA裂解液提取蛋白，應用BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據蛋白濃度加入晶狀體蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，當溴酚藍到達底部時將分離膠轉移至PVDF膜上(200 mA、90 min)，封閉液封閉2 h，分別加入1∶1 000稀釋的Bax、Bcl-xl和caspase-3一抗工作液，4 ℃孵育過夜；TBS-T洗膜1 h后加入1∶5 000稀釋的二抗工作液，室溫孵育2 h；TBS-T洗膜1 h，應用ECL發光液顯影，并應用Quantity One 軟件進行灰度分析。以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示各蛋白表達。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 各組小鼠晶狀體混濁度得分比較

A組、B組、C組、D組、E組小鼠晶狀體混濁度得分分別為：0.44±0.72、4.44±0.73、3.67±0.71、2.78±0.97、1.22±0.67。與對照組比較，D-半乳糖組晶狀體混濁度評分明顯升高，差異有統計學意義(F=4.347，P<0.05)；與D-半乳糖組相比，不同濃度AOS干預組晶狀體混濁度評分明顯降低，并且呈濃度依賴性降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 各組小鼠晶狀體HE染色結果比較

對照組小鼠晶狀體上皮細胞呈單層排列，整齊有序；D-半乳糖組小鼠晶狀體上皮細胞稍腫脹，細胞排列不均勻；AOS 150 mg·kg-1·d-1灌胃處理顯著改善了晶狀體上皮細胞的形態結構及排列紊亂。見圖1A～C。

2.3 各組小鼠晶狀體Bax、Bcl-xl和caspase-3蛋白表達比較

與對照組相比，D-半乳糖組小鼠晶狀體Bcl-xl蛋白表達明顯減少，Bax、caspase-3的蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(F=6.62～9.16，P<0.05)；與D-半乳糖組相比，D-半乳糖+AOS各劑量組(C、D、E組)小鼠晶狀體Bcl-xl的蛋白表達明顯增加，Bax、caspase-3的蛋白表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；不同濃度AOS干預組小鼠晶狀體Bcl-xl的蛋白表達呈濃度依賴性增加，E組與C組比較差異有統計學意義(P<0.05)；不同濃度AOS干預組小鼠晶狀體Bax、caspase-3蛋白表達呈濃度依賴性減少，E組與C組、D組差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表1。

3 討 論

白內障是老年人常見致盲性眼病，衰老是老年人白內障的重要病因之一。研究表明，晶狀體上皮細胞受損與白內障的發生和發展有密切聯系，除先天性白內障外，晶狀體上皮細胞凋亡在多種類型白內障發生中起重要作用[5-6]。D-半乳糖誘導的亞急性衰老模型被廣泛應用于構建衰老嚙齒類動物模型，廣泛應用于增齡性聽力下降[7]、白內障[8]、記憶障礙[9]、腎臟衰老[10]、心臟衰老[11]等研究。高劑量半乳糖可誘導產生過量活性氧，從而促進晶狀體上皮細胞的脂質過氧化[12]。此外，多項研究表明，D-半乳糖通過損傷晶狀體上皮細胞促進白內障形成[13-14]。晶狀體上皮細胞凋亡是多種類型白內障發生的細胞學基礎[6,15-16]。研究表明，經D-半乳糖處理后的動物表現為氧化應激損傷與糖基化反應同時存在，導致晶狀體上皮細胞的細胞核和線粒體功能、結構損傷，進一步引起細胞凋亡[17-18]。此外，D-半乳糖在氧化酶的作用下分解形成木酮糖和CO2，并產生氧自由基和H2O2，導致晶狀體氧化損傷，進一步導致晶狀體混濁[19]。本實驗結果表明，應用D-半乳糖處理后的小鼠晶狀體混濁度評分明顯增加，細胞凋亡相關蛋白Bcl-xl蛋白的表達明顯降低，Bax、caspase3蛋白表達明顯增加，表明D-半乳糖可以誘導白內障的發生，其機制可能與細胞凋亡有關。

組別BaxBcl-xlcaspase-3A組1.00±0.001.00±0.001.00±0.00B組1.78±0.160.42±0.171.47±0.23C組1.28±0.230.71±0.271.37±0.17D組1.13±0.301.04±0.231.21±0.27E組0.62±0.361.15±0.190.57±0.37

根據晶狀體的混濁程度可進行白內障病情分級。晶狀體混濁通常從周邊開始出現空泡，逐漸向中心發展，最終出現核混濁[20]。病理改變主要表現為晶狀體細胞結構破壞以及晶狀體纖維水腫、崩解等[21-22]。AOS因其無免疫原性、無毒性、可生物降解等優點而被應用于生物醫學領域。已有研究表明，AOS對肺動脈高壓[23]、心血管疾病[24]、腎臟損傷[25]等具有重要保護作用，但其對白內障的影響卻鮮有研究。本研究結果顯示，D-半乳糖組小鼠晶狀體混濁度評分明顯升高，AOS干預顯著改善了晶狀體上皮細胞的形態結構及排列紊亂，表明D-半乳糖誘導了C57BL/6J小鼠白內障的發生，AOS顯著延緩了D-半乳糖誘導的C57BL/6J小鼠白內障的進展。本研究顯示，應用不同濃度的AOS干預后，小鼠晶狀體混濁度呈濃度依賴性降低，高劑量組降低效果最為明顯；晶狀體上皮細胞的形態結構及排列紊亂得到明顯改善；且細胞凋亡相關蛋白Bcl-xl表達呈劑量依賴性增加，而Bax、caspase3蛋白表達呈劑量依賴性減少，以高劑量組效果最為明顯。表明AOS可以延緩白內障的發生，其機制可能與抑制細胞凋亡有關。

細胞凋亡是為了維持內環境穩定，在基因調控下的細胞程序性死亡，受多種基因如Bcl-2家族Bax、Bcl-xl以及caspase家族中的caspase-3等調控。Bax屬于Bcl-2家族中重要的凋亡調節基因，Bax的過度表達可以拮抗Bcl-2的保護作用，從而促進細胞凋亡。Bcl-xl是Bcl-2家族基因中重要的拮抗細胞凋亡基因，可與Bax結合形成異二聚體，發揮抑制細胞凋亡的作用[26-28]。JING等[29]在研究過氧化氫誘導的人晶狀體上皮細胞凋亡時發現，Bax、caspase-3的mRNA表達明顯增加，表明其在細胞凋亡中發揮重要作用。caspase-3是近年來發現的在細胞凋亡中起關鍵作用的蛋白酶[30-31]。有研究表明,老年白內障病人和中青年白內障病人晶狀體上皮細胞凋亡與caspase-3的表達水平呈正相關。本實驗結果顯示，與對照組相比較，D-半乳糖組小鼠晶狀體Bcl-xl蛋白表達明顯減少，Bax、caspase-3蛋白表達明顯增加；與D-半乳糖組相比，AOS干預各組小鼠晶狀體Bcl-xl的蛋白表達呈劑量依賴性增加，Bax、caspase-3蛋白表達呈劑量依賴性減少，以高劑量組效果最為明顯，表明白內障的發生與細胞凋亡相關蛋白Bcl-xl、Bax和caspase-3的表達有關。

綜上所述，AOS顯著延緩了D-半乳糖誘導的C57BL/6J小鼠白內障的進展，其機制可能與AOS抑制晶狀體細胞凋亡有關。但其具體分子調控機制仍需進一步研究。