響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助復(fù)合酶法水解蝦頭蛋白的工藝*

何穎恒，余學(xué)玲，陳旭新

（福建東威食品有限公司，福建 福清 350315）

白對(duì)蝦蝦肉質(zhì)嫩爽口又營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，因而廣受人們歡迎。白對(duì)蝦絕大多數(shù)器官在蝦頭中，蝦頭重量將近全蝦的一半。蝦頭中含有大量的有益物質(zhì)和微量元素[1,2]。蝦頭在多酚氧化酶的作用下會(huì)變褐色，且一般不被消費(fèi)者食用。因此，大多數(shù)食品處理廠會(huì)將蝦頭分離，只剩蝦的軀干部分再出售。隨著白對(duì)蝦養(yǎng)殖和銷售規(guī)模的不斷擴(kuò)大，大量的蝦頭常被丟棄，不僅造成了蝦頭資源的大量浪費(fèi)，還可能導(dǎo)致一定程度的環(huán)境污染。

為了挖掘蝦頭的價(jià)值，張樣剛等人[3]分析了南美白對(duì)蝦蝦頭的一般化學(xué)組成；彭燕等人[4]分析了南美白對(duì)蝦蝦頭的氨基酸組成。由于蝦頭富含蛋白和氨基酸，通過(guò)蛋白酶水解可進(jìn)一步提高其呈味氨基酸的含量以賦予其更濃郁的鮮味，因而蝦頭蛋白水解液常被用于開(kāi)發(fā)蝦味調(diào)味料[5-10]。高志中[6]等人進(jìn)行了海蝦風(fēng)味料的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用；劉素磊[7]利用酶解的方法對(duì)南美白對(duì)蝦蝦頭調(diào)味汁進(jìn)行了研究；李天琪[8]等用GC-MS手段分析蝦調(diào)味料的風(fēng)味得出在酶解的基礎(chǔ)上添加生姜油可以提高其風(fēng)味及功能；岑劍偉[9]等人研究了海鮮醬制備工藝技術(shù)；錢飛[10]等人對(duì)克氏原螯蝦蝦頭酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行了大量的分析；徐坤華[11]等人分析了堿性蛋白酶水解中華管鞭蝦蝦頭的工藝優(yōu)化。為了提高蝦頭蛋白的水解度，本試驗(yàn)以南美白對(duì)蝦蝦頭為原料，通過(guò)添加蛋白酶和用超聲輔助處理來(lái)制備蝦頭蛋白的水解液，探討了蛋白酶類型、蛋白酶添加量、料液比、pH值、超聲功率、超聲時(shí)間、酶解溫度和酶解時(shí)間這8個(gè)因素對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化最佳的超聲和酶解條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蝦頭：由福清市東威水產(chǎn)食品實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.1.2 主要試劑：中性蛋白酶，堿性蛋白酶，酸性蛋白酶、酸性復(fù)合肽酶和復(fù)合肽酶PR50G，由杜邦公司提供。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備：數(shù)控超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀，購(gòu)自海能儀器有限公司；臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)，購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；弗魯克電動(dòng)攪拌器，購(gòu)自上海弗魯克科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蝦頭預(yù)處理

將冷凍蝦頭解凍，再用高速粉碎機(jī)破碎成泥狀，以備后續(xù)處理。

1.2.2 工藝流程

蝦頭解凍→沸水煮沸→超聲→震蕩酶解→沸水煮沸滅酶→離心→測(cè)氨基酸態(tài)氮含量

1.2.3 總氮含量的測(cè)定方法

根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中規(guī)定的凱氏定氮法測(cè)定蝦頭中的總氮含量。

1.2.4 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定方法

根據(jù)GB 5009.235—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中規(guī)定的酸度計(jì)法測(cè)定氨基酸態(tài)氮含量

1.2.5 水解度的測(cè)定

蛋白質(zhì)的水解度（DH）代表其在水解過(guò)程中肽鍵被裂解[12]的程度。

計(jì)算式為：

式中：

T為蝦頭中總氮含量，g/100g；

X1為酶解液中氨基酸態(tài)氮含量，g/100g；

X0為未酶解的蝦頭中游離氨基酸態(tài)氮含量，g/100g。

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 蛋白酶類型對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

取經(jīng)破碎處理后的蝦頭泥10 g，按料液比為1∶10加入蒸餾水，沸水煮5 min后冷卻，分別調(diào)節(jié)pH值至各個(gè)蛋白酶的最適值（分別為6.6、8.5、2.8、4.0、4.0），超聲功率300 W超聲處理40 min，按占蝦頭泥重量的1%分別加入中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、酸性復(fù)合肽酶、復(fù)合肽酶PR50G，在最適溫度（分別為55、58、55、53、53 ℃）下攪拌酶解2 h，沸水中煮10 min使酶失去活性，4000 r/min下再離心20 min，取上清液，測(cè)定其水解度。

1.3.2 蛋白酶添加量對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

取經(jīng)破碎處理后的蝦頭泥10 g，按料液比1∶10加入蒸餾水，pH值調(diào)節(jié)至8.5，超聲功率300 W超聲處理40 min，將堿性蛋白酶按占蝦頭重量的0.01%、0.1%、1%的量分別加入，在58 ℃攪拌酶解2 h，沸水中煮10 min使酶失去活性，4000 r/min下再離心20 min，取上清液，測(cè)定其水解度。而中性蛋白酶的處理為，pH調(diào)節(jié)至6.6，55 ℃下攪拌酶解2 h，其余做同樣處理。

表1 響應(yīng)面分析法的因素和水平

1.3.3 料液比對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

取經(jīng)破碎處理后的蝦頭泥10 g，分別按料液比1∶8、1∶10、1∶12加入蒸餾水，沸水煮5 min后冷卻，調(diào)節(jié)pH至7.5，超聲功率180 W處理30 min，按蝦頭泥重量加入1%的堿性蛋白酶和1‰中性蛋白酶，在50 ℃下攪拌酶解3 h，之后沸水中煮10 min使酶失去活性，4000 r/min下離心20 min，取上清液，測(cè)定其水解度。

1.3.4 pH對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

考察pH分別為6.5、7.5、8.5時(shí)所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除pH外其他工藝條件同于1.3.3。

1.3.5 超聲功率對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

考察超聲功率分別為150、180、210 W時(shí)所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除超聲功率外其他工藝條件同于1.3.3。

1.3.6 超聲時(shí)間對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

考察超聲時(shí)間分別為10、20、30、40 min時(shí)所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除超聲時(shí)間外其他工藝條件同于1.3.3。

1.3.7 酶解溫度對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

考察酶解溫度分別為30、40、50、60 ℃時(shí)所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除酶解溫度外其他工藝條件同于1.3.3。

1.3.8 酶解時(shí)間對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

考察酶解時(shí)間比分別為1、2、3、4 h時(shí)所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除酶解時(shí)間外其他工藝條件同于1.3.3。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)比單因素試驗(yàn)結(jié)果的顯著性，選取pH值、酶解溫度、超聲功率以及超聲時(shí)間為因素，以水解度為響應(yīng)值，選擇3水平進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用 Excel、SPSS和Design-Expert軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均所得的平均值。當(dāng) P＜0.05 時(shí)，差異性顯著；當(dāng)P＜0.01，差異性極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 蛋白酶類型對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

圖1 蛋白酶類型對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

由圖1可知，5種蛋白酶在最適的pH和溫度下，經(jīng)攪拌酶解3 h后，以堿性蛋白酶的水解效果較為理想。通過(guò)顯著性分析可以看出，堿性蛋白酶的水解度顯著高于其他蛋白酶；其次是中性蛋白酶，其水解效果弱于堿性蛋白酶，是由于它是內(nèi)切酶的一種，其作用位點(diǎn)不在蛋白質(zhì)的表面，不能準(zhǔn)確地進(jìn)行酶解反應(yīng)，因而水解作用減弱。酸性蛋白酶的酶解效果也要弱于前兩者。復(fù)合肽酶PR50G和酸性復(fù)合肽酶的水解效果較為一般。因此，我們選擇了堿性蛋白酶與中性蛋白酶進(jìn)行雙酶的復(fù)合酶解。

2.1.2 蛋白酶添加量對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

圖2 蛋白酶添加量對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

由圖2可知，隨著蛋白酶添加量的增大，堿性蛋白酶的水解效果逐漸顯著增強(qiáng)，而中性蛋白酶則在0.1%的添加量下為較高值，當(dāng)添加量為1%時(shí)，其水解度發(fā)生顯著下降。因此，中性蛋白酶的較優(yōu)添加量為0.1%，而在堿性蛋白酶上，出于成本的考慮，我們將其添加量定為1%。

2.1.3 料液比對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

圖3 料液比對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

由圖3可知，從料液比1∶8到1∶10，其水解度顯著增加；從料液比1∶10到1∶12，其水解度無(wú)顯著差異。當(dāng)料液比為1∶8時(shí)，底物中蝦頭的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大，則其水解液的黏度就會(huì)遠(yuǎn)超于正常值，進(jìn)一步導(dǎo)致酶在酶解過(guò)程中的速度減慢，酶解反應(yīng)的作用效率會(huì)發(fā)生下降。而隨著料液比的增大，水解度沒(méi)有發(fā)生顯著增加。因此，可選擇料液比1∶10。

2.1.4 pH對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

圖4 pH對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

由圖4可知，隨著料液pH值的增加，水解度先上升再下降；當(dāng)料液pH為7.5時(shí)，其水解度較高。本實(shí)驗(yàn)中使用堿性蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行共同酶解。堿性蛋白酶的活力pH范圍為7.0～9.0，中性蛋白酶的活力pH范圍為6.0～7.5；雙酶共同酶解在pH7.5（均在各自蛋白酶的較優(yōu)活力范圍內(nèi)）時(shí)，可獲得較高的水解度。

2.1.5 超聲功率對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

圖5 超聲功率對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

由圖5可知，水解度會(huì)隨著超聲功率的增大而先顯著上升后有顯著降低，在超聲功率為180 W為較高值。這是因?yàn)槌暪β实脑龃螅\(yùn)動(dòng)的速度隨之加快，強(qiáng)化傳質(zhì)，并且也增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞的破碎作用，更有利于水解蝦頭蛋白。而超聲功率過(guò)高會(huì)使溫度快速上升[13]，復(fù)合酶的活性可能會(huì)下降，從而削弱水解作用。因此，實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇180 W超聲功率為宜。

2.1.6 超聲時(shí)間對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

圖6 超聲時(shí)間對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

由圖6可知，從超聲時(shí)間10 min到30 min內(nèi)，蝦頭水解度發(fā)生顯著上升；到40 min時(shí)，其水解度顯著下降；超聲時(shí)間30 min時(shí)為水解度的較高值。當(dāng)超聲處理時(shí)間不充分時(shí)，由于空化作用[14]會(huì)使水解液中產(chǎn)生大量微小的氣泡，這些氣泡受到振動(dòng)會(huì)不斷的重生和破滅，在氣泡被擠壓會(huì)產(chǎn)生巨大的壓力，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與原來(lái)不同，從而影響了水解過(guò)程。而若超聲強(qiáng)度太高，由于超聲波不斷通入水解液中，使得液體中的氣泡不斷受到壓力而使溫度上升且壓強(qiáng)增大，形成了一定數(shù)量的游離基團(tuán)[15]，這些基團(tuán)會(huì)進(jìn)攻復(fù)合酶分子，降低酶的活性，從而減弱了水解反應(yīng)。因此，實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇30 min的超聲時(shí)間為宜。經(jīng)過(guò)超聲波處理的蝦頭蛋白水解度要高于單獨(dú)使用酶法的水解度，也說(shuō)明蝦頭經(jīng)過(guò)一定強(qiáng)度的超聲處理，能夠更好的提取蝦頭蛋白。

2.1.7 酶解溫度對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

圖7 酶解溫度對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

由圖7可知，從酶解溫度30～60 ℃，蝦頭蛋白的水解度開(kāi)始顯著上升而后又顯著降低，在40℃和50℃時(shí)達(dá)到較高值，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異。這是因?yàn)槊附鉁囟瓤梢院艽蟪潭鹊赜绊懨富盍Γ笗?huì)在最適溫度下達(dá)到最高活力值。實(shí)驗(yàn)所采用的中性蛋白酶的最適溫度范圍在50～55℃，堿性蛋白酶的最適溫度范圍則在55～65℃，故而選擇酶解溫度為50℃。

2.1.8 酶解時(shí)間對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

圖8 酶解時(shí)間對(duì)蝦頭蛋白水解度的影響

由圖8可知，隨著酶解時(shí)間的增加，水解度會(huì)逐漸顯著上升，3 h時(shí)為較高，4 h時(shí)的水解度與3 h的差異不顯著，因此單因素實(shí)驗(yàn)中酶解時(shí)間以3 h為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 結(jié)果與方差分析

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

四元二次回歸方程為：

由表3可知，此模型的F檢驗(yàn)值為＜0.0001，失擬項(xiàng)P＞0.05，說(shuō)明非試驗(yàn)因素影響小且誤差小。決定系數(shù)R2=0.9692，說(shuō)明該模型所得出的預(yù)測(cè)值有較好的可信度。校正后的決定系數(shù)Radj2=0.9383，與R2接近。因此可以用于優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析，以確定超聲波輔助復(fù)合酶法水解蝦頭蛋白的最佳工藝。A、B、C、D、AB、BD、 A2、B2、C2、D2的F值均小于0.01，AD、CD的F值大于0.01且小于0.05，其他因子均為不顯著。各試驗(yàn)因素對(duì)蝦頭蛋白的水解度大小的影響依次是A＞C＞B＞D，即pH＞超聲功率＞酶解溫度＞超聲時(shí)間。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖和等高線圖分析

圖9 pH與酶解溫度

由圖9可知，該響應(yīng)面的坡度大且等高線的形狀不圓但較扁，說(shuō)明pH與酶解溫度的交互作用很強(qiáng)。pH坡度更大且等高線聚積，說(shuō)明酶解溫度比前者的影響略低。

圖10 pH與超聲功率

由圖10可知，等高線圖形狀略圓，pH與超聲功率的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響不大。pH的坡度比超聲功率更大且等高線堆積在pH方向，說(shuō)明pH對(duì)水解度的作用更大。

圖11 pH與超聲時(shí)間

圖11 pH與超聲時(shí)間

由圖11可知，pH與超聲時(shí)間共同作用對(duì)響應(yīng)值有較大的影響。pH曲面坡度更大且等高線向pH聚積，說(shuō)明pH對(duì)水解度的影響比超聲時(shí)間更大。

圖12 酶解溫度與超聲功率

由圖12可知，該響應(yīng)面的曲面略平滑、等高線的形狀略扁，說(shuō)明酶解溫度與超聲功率的交互作用對(duì)提取蝦頭蛋白的影響不大。

由圖13可知，該響應(yīng)面不平滑，并且等高線的形狀說(shuō)明酶解溫度與超聲時(shí)間的交互作用極顯著。酶解溫度曲面坡度更大且其對(duì)應(yīng)的等高線更集中，說(shuō)明酶解溫度對(duì)水解度的影響比超聲時(shí)間大。

圖13 酶解溫度與超聲時(shí)間

圖14 超聲功率與超聲時(shí)間

由圖14可知，超聲功率與超聲時(shí)間的交互作用顯著。超聲功率的坡度更大且等高線靠超聲功率方向匯集，說(shuō)明超聲功率對(duì)水解度的影響比超聲時(shí)間略大。

因此，由上述圖可看出以上4因素對(duì)水解度的影響極顯著，與方差分析基本一致。并且可以從6個(gè)等高線圖看出，最佳的pH應(yīng)在7.5～8.0之間、最佳的酶解溫度范圍是45～50 ℃、最佳的超聲功率在174～180 W以及最佳的超聲時(shí)間應(yīng)在25～30 min范圍內(nèi)。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)此模型預(yù)測(cè)超聲波輔助酶法提取蝦頭蛋白水解液的最佳工藝條件是pH7.67、酶解溫度49.09 ℃、超聲功率176.29 W以及超聲時(shí)間29.32min，蝦頭蛋白水解度的預(yù)測(cè)值為43.6684。考慮到實(shí)際情況，對(duì)上述條件進(jìn)行修正，最終的優(yōu)化條件為pH7.5、酶解溫度50 ℃、超聲功率180 W以及超聲時(shí)間30 min。根據(jù)最佳工藝條件，再做三次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，水解度的平均值為42.5，與預(yù)測(cè)值接近，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明優(yōu)化的超聲和酶解條件可行。

3 結(jié)論

超聲波輔助雙蛋白酶法提取蝦頭蛋白的最佳提取工藝條件為：蝦頭泥以料液比1∶10（g/mL）調(diào)配→pH調(diào)節(jié)為7.5→超聲功率180 W下處理30 min→料液中添加1%堿性蛋白酶和0.1%中性蛋白酶→50 ℃下酶解時(shí)間3 h→加熱煮沸10 min→4000 r/min下離心20 min→取上清液，即水解蛋白液；該工藝條件下，蝦頭蛋白水解度可達(dá)到42.5%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超聲時(shí)間由10 min上升到30 min和超聲功率從150 W上升至180 W時(shí)，水解度可顯著性增加。因此，超聲輔助雙蛋白酶水解法是提取蝦頭蛋白的有效方法。