氧化石墨烯介導多功能G-四鏈體發夾探針用于轉錄因子的高靈敏檢測

褚秀玲

（山東省泰安生態環境監測中心，山東 泰安 271000）

人類細胞中含有超過1000種轉錄因子。它們濃度異常變化與許多疾病緊密相連［1］。例如，NF-κB（存在于人體各種細胞內的一類轉錄因子）的異常表達將會導致癌癥、炎癥等嚴重疾病［2，3］，已經用于臨床診斷和開發相關治療藥物。所以，靈敏、快速檢測NF-κB的活性具有非常重要的現實意義。近年來，熒光檢測技術已被用來檢測轉錄因子。最常用的是基于構象轉變的熒光檢測分析方法。該方法過程簡便，但是必須構建結構復雜的探針，大大限制了該方法的應用范圍。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是一種特殊的二維碳納米材料，具有良好的水溶性、優異的機械及熱性能［4］。GO能夠吸附單鏈DNA，并可以淬滅DNA單鏈上標記的熒光，已被用于開發多種生物傳感器［5-8］。本文設計一種具有三重功能的G-四鏈體發夾探針，借助GO對DNA單鏈的高效率吸附和淬滅熒光性能，建立了一種快速、簡單、靈敏的熒光檢測NF-κB p50方法，獲得了滿意結果。

1 實驗部分

1.1 試劑

本文用到的探針（DNA）均由上海生工提供，如表1所示。重組 NF-κB p50購于美國 Cayman Chemical公司，氧化石墨烯水溶液購于南京先豐納米材料科技有限公司，NMM購自Frontiersci。其它試劑均購自上海國藥集團。

DNA儲存液（TE）：10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0。

所用溶液均采用高純水（＞18.25 MΩ）配制。

表1 探針序列Table 1 Details of the DNA sequences of PROBE

表1中粗體為發夾的莖部（即為目標物的識別序列），下劃線區域為發夾的環部，斜粗體部分為探針末端G-四鏈體。

1.2 DNA的分裝、儲存及工作溶液的配制

將新購買的 DNA離心（10000v／min，1min），用TE緩沖液配制成50μmol／L的儲備液，振蕩使其充分溶解后分裝，儲存于-20°C備用。2.5μ mol／L的工作溶液由 10 m mol／L HEPES（50 m mol／L氯化鉀，0.1 m mol／L EDTA，2.5 m mol／L二硫蘇糖醇，10%甘油，pH＝7.4）緩沖溶液稀釋儲備液而成，置于-4°C。

1.3 氧化石墨烯吸附G-四鏈體探針、靶標結合探針、復合物的解離、插入染料及測定熒光

氧化石墨烯和G-四鏈體探針依次加入到20 mM HEPES的緩沖體系中，室溫下吸附反應進行5 min，然后加入靶標NF-κB p50，室溫下與識別探針結合后形成復合物，脫離氧化石墨烯，進行20 min。最后，加入染料NMM到反應體系中，5 min。體系的終體積為50μL，氧化石墨烯、探針和NMM的最終濃度分別為 0.1 mg／mL、50 nmol／L、2.0 μmol／L。測定熒光參數：激發電壓為500 V，激發波長：399 nm，發射波長：620 nm，狹縫：5 nm。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

檢測原理如圖1所示。G-四鏈體發夾探針具有三重功能，環部用于吸附于氧化石墨烯，莖部用于結合靶標，末端G-四鏈體用作輸出信號載體。首先，探針通過π-π堆積作用被快速吸附到氧化石墨烯表面；然后，靶標NF-κB p50特異性結合探針莖部后形成復合物，復合物體積較大，與氧化石墨烯表面的相互作用力減弱，導致脫離其表面；最后，插入內插染料NMM（插入G-四鏈體后熒光信號增強）。靶標不存在時，吸附在氧化石墨烯表面的探針無法自行解離，插入NMM后仍會被氧化石墨烯淬滅，利用熒光變化可以實現對靶標分子的快速、靈敏檢測。

圖1 氧化石墨烯介導多功能G-四鏈體發夾探針高靈敏檢測轉錄因子示意圖Fig.1 Scheme of graphene oxide-mediated multifunctional G-quadruplex hairpin probe for rapid and sensitive detection of NF-κB p50

2.2 NF-κB p50分析的熒光光譜表征

檢測過程中熒光強度的變化如圖2所示。染料自身呈現熒光很微弱（a），當探針加入到含有染料NMM的體系時，熒光強度顯著增大（d）。當氧化石墨烯加入體系后，熒光強度明顯下降（b），這說明插入到探針中的NMM的增強熒光已被氧化石墨烯高效淬滅。當體系中加入靶標NF-κB p50后，熒光強度又顯著增強（c），這說明探針與靶標特異結合成為復合物，體積變大產生位阻效應，與氧化石墨烯親和力變弱，進而脫離從其表面解離，染料NMM的熒光恢復。

圖2 檢測過程中熒光強度的變化Fig.2 The change of fluorescence intensity

2.3 優化實驗條件

為了獲得最佳檢測數據，需要優化實驗條件，包括探針末端G-四鏈體長度、氧化石墨烯濃度、內插染料濃度。

2.3.1 G-四鏈體長度的優化

ΔF（陽性熒光強度與陰性熒光強度之差）隨著G-四鏈體序列長度的增加而增大，當序列堿基數為17時，ΔF最大，因此，選擇堿基數為17的G-四鏈體，對應探針4。

2.3.2 氧化石墨烯的濃度優化

氧化石墨烯的濃度對淬滅效率影響重大，氧化石墨烯濃度增大，熒光強度ΔF先增大后又逐漸降低，當濃度為0.1 mg／mL時ΔF最大。

2.3.3 內插染料濃度的優化

熒光強度隨著NMM濃度的增大而增大，然后又逐漸變小，當染料濃度為2.0μmol／L時，熒光強度達到最大值。

2.4 檢測方法性能

通過測定不同靶標濃度在最佳條件下對應的熒光強度，可以獲得本檢測方法的線性范圍和靈敏度。熒光強度與目標物濃度在0.5～50 nmol／L范圍內時具有線性關系（R2＝0.993），經估算檢測限為0.25 nmol／L，優于文獻報道的其他方法。

3 結論

本文通過設計基于氧化石墨烯高效淬滅性能的多功能G-四鏈體識別探針，成功構建了一種簡單、靈敏、快速的熒光檢測方法，實現了對靶標轉錄因子NF-κB p50的靈敏檢測，LOD分別為0.25 nmol／L。與文獻報道的其他熒光方法相比較，該檢測方法具有如下特點：1）首次設計用于轉錄因子的檢測的三功能識別探針，并且該設計具有通用性，只需要調整對應的識別序列即可實現其它靶標轉錄因子的高效檢測。2）該方法不需要昂貴的切割酶，極大地降低了假陽性信號和檢測成本。