奶粉中沙門氏菌檢測能力驗證結果與分析

柴洪艷 喬璐 陳亮

沙門氏菌在自然界中廣泛存在,易污染水源、食品等,短時間大量增殖[1,2]。沙門氏菌是北京市乃至全國食源性疾病的主要致病菌之一?？芍聰⊙Y和腸炎等[3],對人們身體健康造成危害。能力驗證是保證檢測質量必要手段,可以用來評估檢測能力[4,5]。2017年底,全國共431個實驗室參加了“2017年國家食品安全風險監測網微生物質量控制考核暨2017年國家認監委能力驗證計劃C類項目-食源性沙門菌檢驗分型”。北京鐵路疾病預防控制中心實驗室也參與了該項目,共接到3份奶粉樣品,編號分別為2017S-01(002)-1;2017S-01(002)-2;2017S-01(002)-3,并對3份樣品進行了沙門氏菌檢測且完成血清學分型?，F將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 設備 低溫恒溫培養箱(日本SANYO公司)、VITEK2全自動微生物鑒定系統(法國梅里埃公司)、生物安全柜(美國LABCONCO公司)。

1.2 培養基及試劑 緩沖蛋白胨水(BPW)、四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液、亞硫酸鉍(BS)瓊脂、沙門氏菌顯色培養基、營養瓊脂等均購自北京君立康科技發展有限責任公司和陸橋技術有限責任公司;VITEK 2 GN鑒定卡購自生物梅里埃公司;沙門氏菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業。所有培養基和試劑均在有效期內使用。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理：根據此次考核檢測要求,將裝有凍干菌的西林瓶于室溫下放置15 min復溫;無菌操作打開西林瓶,加入1 mL緩沖蛋白胨水(BPW)溶液進行復溶,室溫靜置3 min;充分混懸西林瓶內容物,靜置30 s,以消除產生的泡沫。

1.3.2 預增菌和增菌：將上述溶液轉移至含有220 mL滅菌BPW的樣品均質袋中,再用滅菌BPW充分洗滌西林瓶內壁4次,每次1 mL,洗滌合并到樣品均質袋中;向樣品均質袋中分別加入相應編號樣品基質袋中的基質,振蕩混勻后,按照GB 4789.4-2016 36℃預增18 h[6];低溫恒溫培養箱中取出輕輕搖動培養過的樣品混合物,移取1mL轉種于TTB內,于(42±1)℃培養24 h。同時,另取1 mL轉種于SC內,于36℃分別培養24 h。

1.3.3 分離：使用一次性接種環分別取增菌液1環,分別劃線接種于BS瓊脂平板和沙門氏菌顯色培養基,BS瓊脂平板36℃培養48 h,沙門氏菌顯色培養基36℃培養24 h。

1.3.4 生化試驗：自選擇瓊脂平板上分別挑取3～5個可疑菌落接種三糖鐵瓊脂。同時接種營養瓊脂平板36℃培養24 h。選取營養瓊脂平板上的純菌落,按VITEK2全自動微生物鑒定系統的要求進行上機鑒定。

1.3.5 血清學鑒定：將VITEK2全自動微生物鑒定系統和三糖鐵結果符合沙門氏菌的菌落進行血清凝集實驗。首先進行生理鹽水對照,如不凝集再進行多價菌體抗原(O)和多價鞭毛抗原(H)抗血清的凝集。

1.3.6 結果判定：根據選擇性培養基菌落特征、三糖鐵初步生化結果和VITEK2全自動微生物系統生化鑒定結果以及血清凝集情況進行綜合判定。

2 結果

2.1 分離菌落形態特征 三份奶粉樣品在不同培養基上菌落形態特征不同,其中2017S-01(002)-2在BS、沙門氏菌顯色培養基、營養瓊脂上均無菌落生長;而2017S-01(002)-1和2017S-01(002)-3均表現為有菌落生長,且特征與沙門氏菌的生長特征基本相符合(表1),2017S-01(002)-2未檢出沙門氏菌。

表1 分離菌落形態特征

2.2 三糖鐵反應結果 2017S-01(002)-1考核樣品產酸產堿,產氣產硫化氫,而2017S-01(002)-3考核樣品產酸產堿,不產氣產硫化氫(表2)。

2.3 系統生化鑒定結果 取營養瓊脂平板上的純菌落進行上機鑒定,其中2017S-01(002)-1和2017S-01(002)-3的VITEK2生化結果見表3和4。

表2 考核樣品在三糖鐵反應結果

表3 2017S-01(002)-1樣品VITEK2生化結果

2.4 生化鑒定結果 從VITEK2全自動微生物鑒定系統生化鑒定結果看出,其中2017S-01(002)-1鑒定為腸炎沙門菌血清型,2017S-01(002)-3被鑒定為沙門菌群,且符合率均較高,分別為98%和99%。

表4 樣品2017S-01(002)-3 VITEK2生化結果

2.5 血清凝集實驗結果 2017S-01(002)-1和2017S-01(002)-3血清凝集情況不同,生理鹽水均不凝集,其中2017S-01(002)-1菌體抗原O4,12、O9,12、O9均凝集,O4 不凝集;鞭毛抗原 Hg、Hm、H1,v、H7均凝集,Hv不凝集。其中2017S-01(002)-1菌鞭毛抗原第二相在初始凝集時不凝集,故作了誘導實驗。用已知的第一相血清做H抗原第二相的誘導凝集試驗,最后第二相凝集。2017S-01(002)-3菌體抗原 O4、O5、O27、O4,12、O9,12 均凝集,O9 不凝集;鞭毛抗原 Hd、H1,v、H1,2,3,5、H2 均凝集,Hv、H5 不凝集(表5)。

表5 血清凝集情況

2.6 鑒定結果 根據選擇性培養基、三糖鐵和VITEK2全自動微生物系統生化鑒定結果以及血清凝集情況綜合判定為2017S-01(002)-2未檢出沙門氏菌。 2017S-01(002)-1、2017S-01(002)-3盲樣分別為檢出腸炎沙門氏菌、檢出斯坦利沙門氏菌。

3 討論

3.1 通過能力驗證可以提高實驗室檢測水平,確保結果的準確性,同時發現檢測問題,及時改進糾正[7,8]。沙門菌屬血清型別較多,對檢測人員技術水平和經驗有較高的要求[9]。此次能力驗證三份奶粉樣品檢測準確率達100%,與指定菌一致,能力驗證結果滿意,驗證了實驗室沙門氏菌的檢驗能力。

3.2 此次沙門氏菌能力驗證表明,在打開樣品進行初步分離時,必須按能力驗證要求操作,這與相關報道一致[10]。首先在室溫放置幾分鐘,其次加入的初次增菌液的次數按要求加入,且反復吹打,盡量使西林瓶內的所有細菌都洗脫下來,有時能力驗證所含細菌量少,如果不按此步操作,很容易造成細菌漏檢。

3.3 GB4789.4-2016 5.3中要求劃線接種BS平板和XLD平板(或HE平板或沙門顯色培養基),3種平板可以自選其一。沙門氏菌顯色培養基菌落特征明顯,容易識別[11],可直接對菌落進行初篩[12,13]。使檢測者根據顏色特征能初步判定結果方向,可基本排除與沙門氏菌屬特征相近的其他細菌,提高檢測效率。此次能力驗證試驗提示沙門氏菌顯色培養基優于XLD和HE培養基。

3.4 此次能力驗證中,2017S-01(002)-1號奶粉樣本通過VITEK2全自動微生物鑒定系統鑒定為腸炎沙門菌血清型,但在實際工作中必須按照國標方法要求進行血清凝集試驗,綜合菌落特征、三糖鐵、生化結果才能最終判定檢驗結果。

3.5 沙門氏菌血清凝集時難點在H抗原的第二相誘導[14],此次沙門氏菌的能力驗證,在血清凝集部分,做了誘導試驗。傳統的方法是使用瓊脂粉,用水溶解后再高壓滅菌,制成平板或U型管,且每次需要現用現配,過程繁瑣。本次能力驗證為了適應實際需要,改進了原有的半固體瓊脂的配制方法,將儲備的營養瓊脂和營養肉湯煮沸冷卻至50℃左右,使用無菌大試管,分別加入4 mL、5 mL、6 mL營養瓊脂,再加入營養肉湯至20 mL,制成不同濃度的半固體瓊脂溶液,倒入平板,凝固后進行誘導試驗,此次能力驗證菌株在加入6 mL營養瓊脂的比例濃度中誘導情況最好。此方法不僅簡單便于操作,更能根據不同沙門氏菌的菌株特點,多制備幾個濃度,以免半固體瓊脂平板太軟或太硬影響凝集效果,能夠盡可能早出具檢測報告。另外要從蔓延生長的菌苔邊緣挑取菌落凝集[15],否則影響凝集效果。