AM 真菌對桑樹根圍土壤團聚體的影響機制*

肖玖軍，邢 丹，毛明明，王 巖

（1. 貴州省山地資源研究所，貴陽550001；2. 貴州省農業科學院蠶業研究所，貴陽 550006；3. 貴州大學農學院，貴陽 550025）

以貴州為中心的西南地區是我國巖溶分布的典型區域，由于長期土地利用不合理、土壤瘠薄、水土流失嚴重、抗侵蝕能力較差，現已成為制約該區域可持續發展的重要生態環境問題[1]。因此，選擇水土保持能力強并兼具喜鈣、石生、旱生等特點的植物進行恢復重建，是實現該地區生態環境治理的關鍵[2]。土壤團聚體作為土壤結構的基本單元，對土壤水分滲透與保持、表層土壤侵蝕及植物生長影響較大，其穩定性是評價土壤抗蝕性的主要指標之一[3]。通常利用大團聚體（粒徑＞ 0.25 mm）百分含量、團聚體平均質量直徑（Mean weight diameter，MWD）、幾何平均直徑（Geometric mean diameter，GMD）和團聚體破壞率（Percentage of aggregate destruction，PAD）反映土壤團聚體穩定性[4]。在退化生態系統植被恢復過程中，叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌能與大部分植物形成共生關系，可促進植物生長及土壤團聚體的形成和穩定，從而提高巖溶等退化生態系統植被重建的成功率、保證修復效果的持續性和穩定性[5]。其中，AM 真菌的菌絲隨宿主植物根系生長分泌產生一類具有“超級膠水”性能的特異性蛋白，即球囊霉素相關土壤蛋白（Glomalin-related soil protein，GRSP），是土壤團聚體形成的重要黏合劑，能夠提高土壤水分的滲透力和土壤穩定性、多孔結構[6]。接種 AM 真菌能夠提高 GRSP 含量，進而促進土壤大團聚體形成并增強土壤結構穩定性[7]，因而 GRSP 作為有機膠結物質對土壤團聚體的形成和穩定具有重要的促進作用[8]。桑樹（Morus alba）易與AM 真菌形成共生關系[9]，但巖溶生態系統利用接種 AM 真菌的桑樹進行植被恢復過程中，桑樹根圍土壤GRSP 對土壤團聚體改善及土壤結構的穩定性是否有明顯的促進作用尚需探索。

土壤團聚體的形成與穩定對土壤有機碳（Soil organic carbon，SOC）具有重要的物理保護作用，而SOC 是各粒級團聚體形成與穩定的重要膠結劑，與 GRSP 同是土壤團聚體形成與穩定的主要驅動因子[10]。AM 真菌等對土壤團聚體的改善會影響各粒級團聚體的 SOC 含量，也可為SOC 提供更多的物理保護，防止其被土壤生物分解[11]。但是，桑樹接種AM 真菌后其根圍土壤各粒級團聚體中的SOC 如何變化尚不清楚。而SOC 與GRSP 關系密切，二者含量提高可改善土壤團聚體穩定性[12]。據此推測，在AM 真菌作用下桑樹根圍土壤團聚體的形成與穩定會同時受到GRSP 和SOC 的影響。本研究選擇石漠化桑園土壤為供試土壤，分析接種AM 真菌后土壤團聚體組成與穩定性的變化，探討 AM 真菌對SOC、GRSP 及土壤團聚體的改善效應和潛在機制，從而為巖溶區桑樹生長營造良好的土壤環境提供理論與技術依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌劑摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae）和根內根生囊霉（Rhizophagus intraradices）由廣西農業科學院微生物研究所提供。以河沙為基質、三葉草（Trifolium repensL.）和玉米（Zea maysL.）為宿主進行擴繁，供試菌劑包含孢子（孢子密度為112～137 ind·10 g-1）、菌絲、侵染根段及河沙。

供試桑樹品種為桑特優 2 號，種子用 0.5%NaClO 表面消毒20 min，無菌水沖洗若干次后播種于滅菌河沙培養，期間噴灑無菌水保持河沙濕潤，2個月后用于接種菌劑。桑樹無菌苗培育過程在廣西農科院微生物研究所溫室進行。

供試土壤采自貴州省農業科學院石漠化桑園，為石灰性土壤。土壤風干后，利用10 KGy 的鈷-60輻照滅菌。土壤主要性質為：pH 6.70，有機質43.63 g·kg-1，全氮 3.69 g·kg-1，全磷 0.337 g·kg-1，全鉀 3.76 g·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗于貴州省農業科學院蠶業研究所溫室條件下進行，設CK（對照）、Fm（接種F. mosseae）和Ri（接種R. intraradices）3 個處理，每個處理設 3個重復，共有9 盆，完全隨機排列。將滅菌后的土壤裝至塑料桶，每桶裝入滅菌土 5.0 kg、施加菌劑50 g（對照加等量的滅菌菌劑）。

具體操作過程為：先將滅菌的土壤裝至塑料桶高度的2/3 處；隨后選取 2 株長勢一致的桑苗將其根系均勻蘸滿菌劑30 g，將桑苗和剩余菌劑移入已裝滅菌土的桶中心位置；將桑苗固定后裝入剩余的滅菌土，確保成功移栽桑苗。桑苗培養期間，所有處理正常供水，每2 d 少量多次澆200 mL·桶-1滅菌水，生長溫度 25～28 ℃，光照時間 8～10 h·d-1。在石漠化生境中，一般持續放晴7 d 需及時為植物補充水分確保生長良好[13]。因而，本試驗對桑樹接種培養40 d 后不再供水，自然干旱7 d 后觀測桑樹根圍土壤團聚體狀況。

1.3 樣品采集與分析

試驗結束后，用直尺測量每個處理桑苗株高，數顯游標卡尺測量地徑。以桑苗地徑為中心，挖取其半徑5 cm、深10 cm 范圍內土壤與根系，抖落收集根系周圍土壤后清洗根系。將每株幼苗根系剪成1 cm 長的小段用于測定AM 真菌侵染率，其測定參照 Phillips 和 Hayman[14]曲利苯藍染色法并適當改進。按 0、10%、20%、…、100%的侵染數量給出每條根段的侵染率。

土壤團聚體粒級分級采用干篩和人工濕篩相結合的方法[4，15]進行，收集各粒級土樣，50℃烘干、稱重后保存，用于各粒級土壤GRSP 和SOC 含量測定。其中GRSP 分為易提取（easily extractable，EE）-GRSP 和總（total，T）-GRSP 兩個組分，參考文獻[16-17]方法測定；SOC 采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定[18]。

1.4 相關計算

每個處理樣品AM 真菌侵染率的計算公式為：

土壤團聚體穩定性以 MWD、GMD 和 PAD 反映，其計算公式如下：

式中，Wi為各級團聚體的百分含量，mi為各處理中i 級（分別為 0.25～5 mm 大團聚體、0.053～0.25 mm微團聚體和＜0.053 mm 粉黏團聚體3 個級別）團聚體質量（g），∑mi為各處理土壤樣品總質量（g），Xi為i 級范圍內團聚體的平均直徑（mm）。

土壤 T-GRSP、土壤 E-GRSP 和土壤 SOC 含量的計算公式為：

式中，T-GRSPi、EE-GRSPi和 SOCi分別為 i 級土壤的T-GRSP、EE-GRSP 和SOC。

AM 真菌對土壤SOC 的效應，計算公式為：

土壤T-GRSP 和土壤E-GRSP 對土壤SOC 的占比，計算公式分別為：

1.5 數據處理

試驗采用SPSS 23.0 對數據進行單因素方差分析、Duncan 多重比較、相關分析；用SigmaPlot 13.0繪圖。采用結構方程模型（Structural equation modeling，SEM）中貝氏估計法解析GRSP 和SOC對團聚體形成與穩定性的影響作用，參照吳明隆[19]所述，借助IBM SPSS Amos 21.0 執行模型運算，過程如下：

1）根據理論文獻繪制假設的因果模型圖，即完成模型構建；

2）開啟數據文件讀入測量指標變量，并界定潛在變量、誤差變量的變量名稱；

3）根據分析屬性選擇要呈現的統計量，需增列平均數及截距項的估計，隨后選擇貝氏估計法工具圖像按鈕執行貝氏分析操作。

4）當貝氏估計窗口中聚斂統計量（Convergence statistic，C.S.）數值小于1.002 時，表示各參數估計值已達到聚斂標準，此時按下“暫停抽樣”結束估計程序。

5）根據適配測量值等判別假設模型與數據是否匹配，其中事后預測p 值（Posterior predictive p，PPp）合理范圍為0.05～0.95 之間，而當此值數據介于0.25～0.75 時表示假設模型為適配模型。

2 結 果

2.1 AM 真菌侵染率、團聚體粒級分布和穩定性

接種AM 真菌47 d 后，桑樹根系鏡檢可觀察到菌絲和泡囊結構，說明 AM 真菌已成功侵染。其中Fm 處理的侵染率（47.53%）顯著高于Ri（43.10%），且兩者均顯著提高桑樹的株高和地徑（表1）。圖1a顯示，Ri 處理大團聚體含量顯著增加（增幅為7.20%），Fm 和 Ri 微團聚體含量均顯著降低（降幅分別為19.1%和50.4%），Ri 的效應更為明顯。然而，Fm 顯著增加＜0.053 mm 粒級團聚體含量（36.4%），而Ri 對此沒有顯著影響。綜合而言，各處理不同粒級團聚體的比例由高至低依次為大團聚體、微團聚體、粉黏團聚體，而接種R. intraradices的團聚效應明顯優于接種F. mosseae。圖1b 發現，與CK 對比，接種F. mosseae對MWD、GMD 和PAD 影響不明顯，但接種R. intraradices顯著增加MWD 和 GMD、顯著降低PAD。

表1 AM 真菌侵染率、桑樹株高與地徑Table 1 AM infection rate，plant height and stem diameter of mulberry relative to treatment

圖1 不同處理下土壤團聚體組成與穩定性變化Fig. 1 Composition and stability of soil aggregates relative to treatment

2.2 土壤有機碳和球囊霉素相關土壤蛋白含量

圖2 顯示，Fm 和Ri 處理顯著增加微團聚體SOC含量，但降低其他粒級SOC 含量。與CK 相比，Fm顯著降低大團聚體T-GRSP 含量，對其他粒級影響不顯著；而 Ri 顯著增加大團聚體和微團聚體 T-GRSP含量，顯著降低粉黏團聚體T-GRSP 含量。同一處理各粒級間T-GRSP 含量差異顯著，其中CK 和Fm 微團聚體中最高，而Ri 表現為大團聚體中最高。接種F. mosseae和R. intraradices顯著增加粉黏團聚體EE-GRSP 含量，但接種R. intraradices對大團聚體和微團聚體 EE-GRSP 含量的影響顯著大于接種F.mosseae。同一處理均表現為微團聚體中EE-GRSP 含量最高，而粉黏團聚體中最低。表2 顯示，Fm 和Ri對土壤有機碳的效應為負，尤其Ri 達-9.17%。土壤T-GRSP 的占比在25.5%～76.5%之間，土壤EE-GRSP的占比在4.87%～5.93%之間，并且Ri 均高于Fm。

圖2 土壤有機碳和GRSP 含量Fig. 2 Contents of soil organic carbon and glomalin-related soil protein relative to treatment

表2 不同處理下土壤有機碳變化及接種效應、土壤球囊霉素占比Table 2 Soil organic carbon，effects of AM inoculation and proportion of glomalin-related soil protein in soil organic carbon relative to treatment

2.3 有機碳、球囊霉素相關土壤蛋白對團聚體形成的影響

由圖3 中聚斂統計量C.S.＜1.002、事后預測 p值 PPp 介于 0.05～0.95 之間、差異信息準則DIC＞10，說明模型為適配模型。根據標準化路徑系數可知，T-GRSP、EE-GRSP 和 SOC 對各粒徑組成表現為正向顯著影響。效應分析結果表明（表3），各影響因子總效應表現為 EE-GRSP＞T-GRSP＞SOC，因而EE-GRSP 是影響團聚體組成的主要驅動因子。

圖3 GRSP、SOC 對團聚體組成影響的結構方程模型Fig. 3 Structural equation model（SEM）showing effects of GRSP and SOC on soil aggregate composition

表3 GRSP、SOC 對土壤團聚體組成的效應分析Table 3 Effects of GRSP and SOC on soil aggregate composition

2.4 有機碳、球囊霉素相關土壤蛋白對團聚體穩定性影響

如圖4 a—圖4c 所示，T-GRSP 顯著影響MWD、GMD 和PAD，并對SOC 有顯著的負影響作用，但SOC 對各穩定性指標影響不顯著。EE-GRSP 和SOC對各穩定性指標影響均不顯著（圖4 d～圖4f）。效應分析結果表明（表 4），T-GRSP 是土壤團聚體穩定性的主要影響因子，其總效應最高。

圖4 GRSP、SOC 對團聚體穩定性影響的結構方程模型Fig. 4 SEM showing effects of GRSP and SOC on soil aggregate stability

表4 GRSP、SOC 對土壤團聚體穩定性的效應分析Table 4 Effects of GRSP and SOC on soil aggregate stability

3 討 論

3.1 AM 真菌對土壤團聚體、GRSP 及SOC 的影響

干旱脅迫條件下，AM 真菌通過影響土壤大團聚體的形成和水穩性團聚體穩定性調節土壤結構[20]。汪三樹等[21]研究表明，石漠化區域桑樹地梗土壤粒徑大于0.25 mm 的水穩性團聚體含量為30.78%～45.19%，濕篩條件下距地埂30 cm 處土壤MWD 和GMD 變化范圍分別為0.507～0.785 mm 和0.220～0.315 mm。彭思利等[22]通過對小麥接種AM 真菌后，利用濕篩法對西南地區中性紫色土土壤團聚體相關指標分析表明，其中接種F. mosseae的菌根室中＞0.25 mm 水穩性團聚體含量、MWD 和GMD 分別較根室高出15.7%、29.2%和17.9%。本研究發現，接種R. intraradices的桑樹根圍土壤大團聚體百分含量、MWD 和GMD 顯著提高，而PAD 顯著降低，表明 AM 真菌對土壤團聚體形成及抵抗雨水侵蝕有積極作用。這種作用可能是因為外延菌絲將土壤機械的纏繞在一起，從而影響土壤水穩性大團聚體的形成及穩定性[7-8]。研究表明，AM 真菌侵染率與菌絲密度呈正相關關系[16]，所接菌劑侵染率高則對土壤團聚體形成與水穩性具有更明顯的促進作用。然而，本試驗結果與其相反，實際表現為接種R. intraradices侵染率低于接種F. mosseae，但對改善土壤團聚體形成及增強土壤團聚體的水穩定性的效果最為顯著。這與植物接種 AM 真菌菌絲、孢子所釋放的GRSP 有一定關系[15]。

GRSP 廣泛存在于自然界，其黏附能力較其他碳水化合物強3 倍～10 倍，可將土壤細小顆粒膠結成較大的土壤團粒結構，因而被稱為“超級膠水”[23]。本研究結果顯示，接種R. intraradices菌劑后，土壤大團聚體、微團聚體 T-GRSP 含量和粉黏團聚體 EEGRSP 含量均顯著提高，從而說明接種R. intraradices的桑樹根圍土壤GRSP 對大團聚體改善及穩定性有明顯的促進作用。AM 真菌能夠分泌 GRSP，其主要成分是蛋白質和碳水化合物，是SOC 形成的重要來源，目前已被視為土壤有機碳庫的重要組成之一[24]。本研究結果（圖 2，表 2）顯示，接種AM 真菌降低大團聚體卻增加微團聚體中SOC 含量，并且接種F. mosseae處理中T-GRSP 和EE-GRSP 含量較低，對SOC 占比有所降低，但接種R. intraradices釋放的GRSP 較多，對SOC 占比明顯較高。這說明AM 真菌與桑樹根系短期共生時，大團聚體中SOC 易分解，較不穩定，而微團聚體對SOC 有重要的物理保護作用，增強了SOC 的固持能力。同時，接種AM 真菌對SOC 的影響，與菌劑類型及其釋放的 GRSP 含量差異顯著有關。已有研究發現，AM 真菌釋放的GRSP 含量與根際環境（如土壤含水量）、AM 真菌特性（如菌絲密度）密切相關[25]，后期可能需要探索不同水分條件下、不同孢子數的菌劑釋放GRSP 能力，進而對SOC 貢獻。

3.2 GRSP、SOC 對團聚體組成與穩定性的影響機制

GRSP 和 SOC 是土壤團聚體形成的重要膠結劑。本研究結果（圖3，表3）顯示T-GRSP、EE-GRSP和SOC 對團聚體形成的直接效應均為正，并且對團聚體形成的影響顯著，從而解釋GRSP 與SOC 兩種膠結物質能夠增強土壤團聚體的膠連作用，使微團聚體黏結在一起，進而通過菌絲體纏繞形成大團聚體[26]。并且，T-GRSP 和 EE-GRSP 對 SOC 產生顯著的正效應，表明SOC 受GRSP 影響。AM 真菌產生的 GRSP 是團聚體中有機碳組成部分之一，其濃度高低影響SOC 含量變化，進而通過 SOC 對團聚體形成產生間接效應[27]。因此，各膠結劑對土壤團聚體形成的影響需要綜合直接效應和間接效應進行評價，即討論總效應，其中 T-GRSP、EE-GRSP 和SOC 所產生的總效應分別為0.25、0.29 和0.09，表明AM 真菌參與過程中GRSP 對團聚體形成起重要作用。這可能是GRSP 包含有豐富的官能團、礦物質、Ols、Si2p、Al2p 等元素、蛋白質、腐殖酸等有關[28]，這些組分是土壤團聚體形成的基礎與核心[29]。同時，研究結果顯示，微團聚體組成高于粉黏團聚體，且微團聚體中GRSP 含量明顯較高，表明土壤團聚體形成過程中，作為“超級膠水”的GRSP 將土壤粉黏團聚體膠結為微團聚體，進而形成大團聚體[30]。因而，本研究較為支持Tisdall 和Oades[31]的觀點，即土壤團聚體的形成由小團聚體膠結成大團聚體，下一步研究尚需深入探索具體的形成機制。

土壤團聚體的穩定性是其重要的物理性質，受土壤多糖類物質、有機質等影響。GRSP 是 AM 真菌菌絲分泌的一種糖蛋白，本研究結果（圖4，表4）顯示 T-GRSP 對 MWD 和 GMD 的直接效應大于EE-GRSP，加上通過SOC 對各因子的間接效應后，T-GRSP 產生的總效應仍大于EE-GRSP。T-GRSP 對PAD 的直接效應，加上通過SOC 對PAD 的間接效應，其所產生的總效應小于EE-GRSP。這種因果關系整體反映桑樹接種AM 真菌后，土壤團聚體穩定性易受 T-GRSP 影響。本研究支持了吳強盛等[15]研究觀點，即T-GRSP 和EE-GRSP 對團聚體形成與穩定有分工上的差異，且團聚體穩定性主要依賴 TGRSP。與 EE-GRSP 相比，T-GRSP 的性質十分穩定不容易發生改變，從而引起團聚體穩定性較強[32]。同時，研究結果（圖1 和圖3）還表明，團聚體穩定性強弱與 GRSP 分泌受到 AM 真菌類型影響，接種R. intraradices的效應明顯高于接種F.mosseae，因而在將AM 真菌用于巖溶區土壤質量環境改善時，有必要篩選較有效的菌種，從而獲得更高的效益。

4 結 論

AM 真菌參與下桑樹根圍土壤團聚體得以改善，且接種R. intraradices易于提高大團聚體與微團聚體中T-GRSP 含量，以及粉黏團聚體EE-GRSP 含量。AM 真菌與桑樹根系短期共生時，大團聚體中SOC易分解，較不穩定，而微團聚體對SOC 有重要的物理保護作用，增強了SOC 的固持能力。同時，接種AM真菌對SOC 的影響，與GRSP 含量差異相關，其中接種R. intraradices釋放的GRSP 較多，對SOC 占比明顯較高。此外，GRSP 對土壤團聚體的形成與穩定影響較大，其中土壤團聚體形成主要依賴于EE-GRSP，而穩定性受T-GRSP 影響最大。在將AM 真菌用于巖溶區土壤質量環境改善時，有必要篩選較有效的菌種，從而獲得更高的效益。