高粱自毒物質(zhì)降解細(xì)菌的篩選

石 瑞，張亞琪，馮玉萍，吳 丹

（忻州師范學(xué)院 生物系，山西忻州 034000）

山西是我國(guó)高粱生產(chǎn)的主要省區(qū)之一，連年種植高粱，導(dǎo)致高粱連作障礙嚴(yán)重，影響高粱的可持續(xù)發(fā)展。高粱連作障礙的原因之一是根系分泌自毒物質(zhì)的累積。而根系分泌的自毒物質(zhì)大多是酚酸類物質(zhì)（李雪利，2009），為此篩選高粱自毒物質(zhì)的降解菌對(duì)解決高梁連作障礙至關(guān)重要。

目前已經(jīng)篩選出了降解草莓（杜霄霞，2009）、人參（趙東岳，2013）、蘋(píng)果（祁國(guó)振，2018）、花生（何志剛，2014）、番茄（何志剛，2017）、黃瓜（郭麗園，2015；孫秀，2014）等多種植物根系分泌酚酸類自毒物質(zhì)的細(xì)菌、真菌或放線菌，郭麗園（2015）以外源對(duì)羥基苯甲酸為唯一碳源篩選出了黃瓜自毒物質(zhì)降解菌株，細(xì)菌GLY-P3和放線菌株GLYP1、GLY-P2。 孫秀（2014）以外源肉桂酸為唯一碳源篩選出了黃瓜自毒物質(zhì)降解細(xì)菌42-3和降解真菌2-4。樊芳芳等（2016）在高粱連作試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與玉米高粱輪作比較，高粱連作會(huì)降低長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量。吳蕾等（2009）進(jìn)一步研究證實(shí)了酚酸類化合物鄰苯二甲酸、沒(méi)食子酸對(duì)高粱的化感作用。

目前對(duì)高粱自毒物質(zhì)降解菌的篩選鮮有報(bào)道，測(cè)定降解率的方法也較單一，多用紫外分光光度法測(cè)定。所以本試驗(yàn)以此為出發(fā)點(diǎn)，以外源鄰苯二甲酸及沒(méi)食子酸為唯一碳源篩選高粱自毒物質(zhì)降解菌株，旨在提高自毒物質(zhì)降解率，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 連作高粱根際土壤，晉雜16號(hào)高粱種子，福林酚試劑，鄰苯二甲酸，沒(méi)食子酸。初篩固體選擇性培養(yǎng)基（孫秀，2014）：硝酸銨1 g，硫酸銨0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鈉0.5 g，硫酸鎂0.5 g，鄰苯二甲酸或沒(méi)食子酸0.5 g，瓊脂條 15 ～ 20 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.2。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 20 g，pH 7.4 ～ 7.6，蒸餾水 1000 mL。種子發(fā)酵液培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，pH自然。降解率測(cè)定培養(yǎng)基：同初篩固體選擇性培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。方法：去皮的馬鈴薯切塊兒，放入蒸餾水中煮到用玻璃棒可以戳破為止，然后用紗布過(guò)濾，再加入稱好的糖和瓊脂，加熱融化后補(bǔ)水至1000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤樣品的制備 取高粱重茬地根際土壤用于沒(méi)食子酸、鄰苯二甲酸降解細(xì)菌篩選，并于4℃冰箱中保存土壤。

1.2.2 鄰苯二甲酸、沒(méi)食子酸篩選濃度的確定分別制備梯度鄰苯二甲酸溶液與沒(méi)食子酸溶液，濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L。 121 ℃滅菌 20 min，冷卻后倒平板，每個(gè)濃度三個(gè)重復(fù)。將高粱種子用3%過(guò)氧化氫消毒15 min，用蒸餾水沖洗數(shù)次，于凈化工作臺(tái)接入不同處理培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿20粒高粱種子，28℃避光萌發(fā)數(shù)天，觀察種子的生長(zhǎng)情況。

1.2.3 降解菌的初篩

1.2.3.1 土壤懸液制備 采用稀釋法處理采集的高粱根際土壤。稱取高粱根際土10 g，加入裝有90 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，即制成10-1土壤懸液，于28℃富集培養(yǎng)30 min后充分振蕩。土粒沉淀后，吸取1 mL上清液，移入裝有9 mL蒸餾水的試管中，制成10-2土壤懸液，依此類推按10倍稀釋法依次稀釋成 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8土壤懸液。

1.2.3.2 菌涂布 用75%酒精棉清潔凈化工作臺(tái)，將滅菌后的平板、初篩固體選擇性培養(yǎng)基、酒精燈、火柴、封口膜等放入無(wú)菌操作臺(tái)中，紫外滅菌30 min。將手進(jìn)行消毒后進(jìn)入凈化工作臺(tái)進(jìn)行操作，點(diǎn)燃酒精燈將裝有培養(yǎng)基的三角瓶的瓶口在酒精燈上過(guò)火滅菌，倒平板時(shí)將培養(yǎng)基向平板的中部倒。平板中的培養(yǎng)基冷卻后，取10-5、10-6、10-7、10-8四個(gè)濃度的土壤懸液，每個(gè)梯度重復(fù)三個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿100μL土壤懸液，用涂布器從中間向四周涂抹均勻，用記號(hào)筆標(biāo)注清楚后過(guò)火。用封口膜密封，放入恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)。待涂布平板長(zhǎng)出菌落后，肉眼觀察其生長(zhǎng)情況，并將所有具有不同形態(tài)的菌在新的相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離。劃線后，細(xì)菌置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，真菌置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h觀察是否出現(xiàn)明顯的單菌落，若出現(xiàn)特征相同的單菌落，則該分離物種為純種并將其進(jìn)行保存。若不為純種，則可以根據(jù)單菌落的不同特征區(qū)分幾種不同的微生物，分別挑取分離并保存。

1.2.4 降解菌的復(fù)篩

1.2.4.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)王曉敏（2018）報(bào)道的方法稱取沒(méi)食子酸5 mg置于100 mL容量瓶中，蒸餾水溶解，搖勻定容至刻度制成50 μg/mL 的沒(méi)食子酸溶液。 分別取 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL 沒(méi)食子酸溶液于 50 mL 容量瓶中，各加入蒸餾水30 mL，福林酚試劑2 mL，搖勻，1 min后加入6 mL 20%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至刻度，75℃水浴10 min后冷卻至室溫并于760 nm處測(cè)吸光值。調(diào)零溶液除不加沒(méi)食子酸對(duì)照液外，其他試劑條件都相同。將可見(jiàn)分光光度計(jì)開(kāi)機(jī)預(yù)熱20 min后，向比色皿中加入3/4的調(diào)零溶液調(diào)零，然后分別加入待測(cè)液，重復(fù)測(cè)定三次吸光值。

1.2.4.2 細(xì)菌種子培養(yǎng) 將初篩得到的所有細(xì)菌，每種細(xì)菌挑取三個(gè)單菌落，于凈化工作臺(tái)分別用接種環(huán)接種到250 mL三角瓶中 （裝有種子發(fā)酵液培養(yǎng)基20 mL），每株一瓶，用記號(hào)筆做好標(biāo)記，37℃、160 r/min恒溫?fù)u床搖瓶活化30 h左右。

1.2.4.3 調(diào)整OD值 600 nm處調(diào)整種子液OD值在1左右，用滅菌后的發(fā)酵種子培養(yǎng)液調(diào)整稀釋。

1.2.4.4 降解率的測(cè)定 在250 mL三角瓶中裝入50 mL降解率測(cè)定培養(yǎng)基，加1 mL細(xì)菌種子液，于37℃、160 r/min恒溫?fù)u床搖瓶培養(yǎng)4、8、12 h后，分別取發(fā)酵液5 mL于10 mL離心管中，4000 r/min離心10 min，取離心后的上清發(fā)酵液即降解液3 mL于10 mL試管中，添加0.4 mL福林酚試劑，1 min后加入20%碳酸鈉溶液1.2 mL，于75℃恒溫水浴加熱10 min，待冷卻至室溫后，測(cè)760 nm處的吸光值。沒(méi)食子酸降解液稀釋5倍后測(cè)定。

降解率/%=（空白酚酸剩余量-處理酚酸剩余量）/空白酚酸剩余量。（空白：由降解率測(cè)定培養(yǎng)基和不加菌的發(fā)酵培養(yǎng)基組成；處理：由降解率測(cè)定培養(yǎng)基和降解菌種子液組成）。

1.2.4.5 真菌種子液制備及降解率測(cè)定 將分離得到的真菌挑取單菌落劃線分離，待PDA平板上長(zhǎng)出菌落后輕輕將菌株孢子刮起，向篩選到的鄰苯二甲酸與沒(méi)食子酸降解真菌的PDA平板中加入少量滅菌后的0.85%生理鹽水沖洗，洗液倒入滅菌后的錐形瓶中，搖床振蕩，制得單孢子懸液，控制孢子濃度為1×107cfu/mL。測(cè)降解率方法同1.2.4.4。

1.2.5 降解菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 將降解細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線分離，30℃培養(yǎng)；降解真菌在PDA培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線，28℃培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后，觀察菌落的大小、形態(tài)、顏色、透明度、邊緣、表面形狀及菌體的濕潤(rùn)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 由圖1可知，沒(méi)食子酸含量x與吸光度y的回歸方程為：y=0.0665x-0.0439，R2=0.9985，線性范圍為1～10μg/mL。

2.2 降解菌篩選濃度的確定結(jié)果 由圖2可得出，當(dāng)自毒物質(zhì)濃度逐漸增高時(shí)，抑制作用也逐漸增強(qiáng)，發(fā)芽勢(shì)逐漸降低，在濃度為0.5 g/L時(shí)抑制作用更明顯，不發(fā)芽。所以選擇濃度0.5 g/L為高粱自毒物質(zhì)降解菌的篩選濃度。

2.3 降解菌的初篩結(jié)果 經(jīng)過(guò)降解菌的初篩，初步得到兩株降解沒(méi)食子酸的細(xì)菌M-1、M-2以及兩株降解沒(méi)食子酸的真菌M-3、M-4。以鄰苯二甲酸為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基篩選出三株降解鄰苯二甲酸的細(xì)菌L-1、L-2、L-3以及一株降解鄰苯二甲酸的真菌L-4。

2.4 降解菌的復(fù)篩結(jié)果 由圖3可看出，在12 h以內(nèi)降解液中自毒物質(zhì)含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低，表明所篩選的M-1、M-2兩種菌有降解沒(méi)食子酸的能力，空白在12 h內(nèi)變化不明顯；菌M-1在12 h內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，自毒物先升后降，12 h時(shí)降解效果最顯著 （P＜0.01）。菌M-2在12 h內(nèi)，自毒物質(zhì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，12 h時(shí)降解效果最顯著（P＜0.01）。菌M-1降解率為30%，菌M-2降解率為36%。

由圖4可以看出，空白和處理均在4 h時(shí)升高，4 h后經(jīng)過(guò)三株菌處理后的降解液中自毒物都逐漸降低，表明篩選得到的L-1、L-2、L-3三株菌對(duì)鄰苯二甲酸均具有一定的降解能力。其中菌L-2的降解效果最好，12 h時(shí)降解率為41%。菌L-3降解效果好于菌L-1。菌L-1的降解率為32%，菌L-3的降解率為33%。

2.5 降解菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 降解真菌和降解細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征見(jiàn)表1和表2。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用福林酚法在高梁自毒物質(zhì)降解菌的篩選中取得了較好的效果，在連作多年的高粱根際土壤中篩選到了降解沒(méi)食子酸的2株細(xì)菌菌株M-1、M-2以及降解鄰苯二甲酸的三株細(xì)菌 L-1、L-2、L-3， 降解率分別為 30%、36%、32%、41%、33%。其中菌株M-2與L-2降解效果相對(duì)較好。

表1 降解真菌形態(tài)學(xué)特征

表2 降解細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征