B10細胞在益氣升提法治療EAMG大鼠中的作用＊

許夢賢，尚衛兵，魏亞男，姬夢姣，吳顥昕

（南京中醫藥大學基礎醫學院 南京 210023）

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是神經—肌肉接頭處的自身免疫性疾病，在細胞免疫依賴性和補體參與下由乙酰膽堿受體抗體（acetylcholine receptor anti-body，AchR-Ab）介導[1]。其病理特征是對大多數患者的乙酰膽堿受體（AChR）產生自身抗體，或對其他患者的肌肉特異性酪氨酸激酶（MUSK）產生自身抗體，以及對較小亞群中越來越多的其他蛋白產生自身抗體。致病原因是自身抗體引起神經肌肉接頭內乙酰膽堿受體（AChR）數量減少或AChR功能受損。其中B淋巴細胞主要參與AchR-ab的生成，在MG發病機制中發揮發揮著重要的作用[2]。

MG的治療目前是現代醫學的一個難題，治療方法一般有：使用膽堿酯酶抑制劑；免疫抑制劑；免疫吸附法；靜脈注射免疫球蛋白；胸腺摘除手術等方法，近年來關于MG治療的研究主要在分子靶向治療上。這些方法存在易復發或者副作用大等缺點。

中醫里沒有重癥肌無力這個病名，根據其全身無力，呼吸困難，勞累后加重，休息后減輕，眼瞼下垂等這些臨床癥狀，中醫把它歸納為痿癥。《重癥肌無力中醫實踐錄》（人民衛生出版社）中將MG分為7種證型：脾胃氣虛、氣陰兩虛、氣血虧虛、脾腎陽虛、氣虛痰阻、氣虛血瘀及肝腎陰虛[3]。根據李廣文等對全國274例MG病人的統計，其中“脾胃氣虛”型病人所占比例最大[4]。中醫里對痿癥的治法主要包括從肝論治，從脾腎論治，從宗氣論治，從濕論治，從淤血論治，及分經論治等。

其中益氣升提法是臨床上中醫治療MG眾多方法中的代表方法之一。最早可以追溯于《黃帝內經》中《素問·至真要大論》這一篇中：“下者舉之”、“衰者補之”[5]。近代醫家張錫純認為“大氣下陷”是MG的基本病機，而脾胃是氣機升降之本，所以提出用升陷湯和補中益氣湯來治療MG。而黃芪、升麻、柴胡為補中益氣湯和升陷湯的共同藥物。一般在臨床中用益氣升提法配伍時柴胡和升麻用藥的劑量比較固定為10 g，但黃芪的用藥劑量差異較大，從20-150 g不等。而漢代名醫張仲景在《金匱要略》里記載的含有黃芪的方劑中，其中用量為19-75 g。本課題組前期研究也證明了，以黃芪、柴胡、升麻為代表配伍的益氣升提法對治療MG有顯著的療效，并探討不同劑量的黃芪和柴胡、升麻配伍的益氣升提法了對T細胞的影響機制[6]。于是本實驗進一步研究B淋巴細胞在益氣升提法治療MG時的影響機制。

1 材料及方法

1.1 動物材料

1.1.1 動物

實驗動物購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，年齡：4-6周齡；體重：130-150 g；性別：雌性；品系：Lewis大鼠；數量：48只；許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養在南京中醫藥大學中醫腦病實驗室，其為SPF級動物實驗室。

1.1.2 藥物

選用強的松（5 mg∕片）為陽性藥物，其生產批號為018150501，購買于上海信誼藥廠有限公司；中藥購于北京同仁堂股份有限公司，各組藥物劑量如下——益氣升提黃芪低劑量組（以下簡稱“低劑量組”）：黃芪20 g，柴胡10 g，升麻10 g，益氣升提黃芪中劑量組（以下簡稱“中劑量組”）：黃芪40 g，柴胡10 g，升麻10 g，益氣升提黃芪高劑量組（以下簡稱“高劑量組”）：黃芪80 g，柴胡10 g，升麻10 g。黃芪（Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge）、柴 胡（Bupleurum chinense）、升 麻（Cimicifuga heracleifolia Komar），藥材品質的鑒定由南京中醫藥大學基礎醫學院腦病實驗室陶偉偉副教授完成。

1.1.3 試劑和儀器

鼠源AchR-c亞基97-116肽（R（-116定由），序列號為：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI。完全福氏佐劑（CFA）和不完全福氏佐劑（IFA）購買于美國Sigma公司。結核桿菌H37Ra干粉購買于美國Difco Bacto公司。CD19，GAPDH抗體：美國Abcam公司。大鼠CD19，白細胞介素10（interleukin-10）引物由上海生工生物合成。大鼠AchR-Ab、白細胞介素10 interleukin-10ELISA試劑盒夠購買于南京金益柏生物科技有限公司。電泳轉膜儀（Bio-Rad Laboratories，Inc，Hercules,CA，USA）；Tannon-5200全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立動物模型

參考Na L[7]和Baggi F等[8]，通過皮下注射人工合成的Ach多肽的方法，建立EAMG模型[9]。第1 d將等量的PBS含（Rα97-116 100μg、H37Ra1干粉1 mg）溶液與CFA充分混勻的200μL乳劑注射在造模大鼠的肩背部和尾基部；將PBS與CFA等量混勻后的200 mL乳劑注射于佐劑對照組。第30 d和45 d，用IFA替換CFA，其余步驟與上次相同，使其強化免疫。造模周期總共為60 d。

1.2.2 實驗動物模型

模型大鼠癥狀的評判方法采用Lennon VA分級法[10]，按照癥狀的表現一共將造模大鼠分為4級。0級：大鼠沒有明顯的肌無力表現；1級：大鼠的活動減少并且表現出易疲勞的狀態，四肢的力量較差，抓握力減小，撕咬無力，牙齒明顯變長；2級：大鼠的無力表現更加明顯，隆背，大腿外展，偶爾會震顫，行動不穩；3級：大鼠表現出嚴重的肌無力癥狀，撕咬動作和叫聲均已消失，呼吸也開始變得困難，處于瀕死狀態或者死亡。

1.2.3 分組和給藥

在造模之前，將8只大鼠隨機選出，作為佐劑對照組。對剩下的40只大鼠進行造模，在第60天造模結束后對造模的大鼠進行模型評估，將造模后的大鼠隨機分為模型對照組，低劑量組，中劑量組，高劑量組，陽性對照組，每組8只。實際的給藥劑量以人和大鼠1∶8的比例根據體重折算。低劑量組：5.3 g∕（kg·d），中劑量組：8 g∕（kg·d），中劑量組：13.3 g∕（kg·d），陽性對照組：強的松5.4 mg∕（kg·d）（純水溶解），模型對照組給與生理鹽水灌胃30 d。

1.2.4 檢測指標和方法

（1）體重

實驗期間每周進行兩次大鼠體質重測量并記錄。

（2）低頻重復神經電刺激（repetitive nerve stimulation，RNS）衰減率（D）

參照許文華等[11]方法，將10%水合氯醛作為麻醉劑，按照30 mg∕kg的劑量腹腔注射大鼠，選4根針灸針作為電極，在坐骨神經附近肌肉內和腹部皮插入兩根針作為刺激電極和參考電極，在同側的腓腸肌內、跟腱附著處刺入兩根針作為兩個記錄電極，電刺激的頻率分別是3Hz、5Hz、10Hz，每個頻率都連續電刺激10次，檢測系統為BL-420S生物機能系統。RNS衰減率（D）的計算公式為：D（%）=（動作電位1-動作電位5）∕動作電位1作電位位為。

（3）ELISA檢測大鼠外周血中AChR-Ab，IL-10水平

在造模結束之后眼眶取血，靜置30 min后離心15 min，離心條件為3 000 r·min-1、4℃，提取上層血清后置于-20℃冰箱保存用于AchR-Ab水平的檢測。用同樣的方法在給藥結束后取血及提取血清，保存條件相同，根據ELISA試劑盒的說明檢測Achr-ab和IL-10水平。

（4）WB檢測胸腺中CD19蛋白表達

每組大鼠取胸腺30 mg進行檢測，提取蛋白并用BCA法測細胞蛋白濃度。每孔加5μl樣品，Gapdh作為內參。抗體稀釋比例分別為：1∶1 000兔抗鼠CD19抗體及1∶10 000兔抗鼠Gapdh抗體。4℃孵育過夜后用稀釋比例1∶5 000HRP標記的羊抗兔抗體37℃孵育1 h。采用Tanon-5200全自動化發光圖像分析系統進行顯影分析。采集目的蛋白和內參GAPDH的灰度值，計算各樣本蛋白的灰度比值。

（5）RT-PCR檢測胸腺中CD19，IL-10基因表達

每組大鼠取胸腺30 mg進行檢測，使用Trizol試劑提取組織總RNA。加入RNA和其他反應物逆轉錄合成cDNA，合成條件為42℃孵育1 h，90℃孵育5 min后置于冰上冷卻。然后以cDNA為模板進行PCR擴增。大鼠CD19，IL-10引物由上海生工生物公司設計及合成，CD19引物：上游5'-TGAAGAGCCAGACAGCGAGGAG-3'，下游5'GTTCTCATAGCCACTGCCATCCTG-3'；IL-10引物：上游5'-AAAGCAAGGCAGTGGAGCAG-3'，下游5'-TCAAACTCATTCATGGCCTTGT-3'；目標條帶β-action引物：上游5'-AGAACATCATCCCTGCATCC-3'，下 游5'-TG-GATACATTGGGGGTAGGA-3'。以目的條帶與β-action灰度值比值反映CD19和IL-10的RNA相對表達水平。

圖1 各組大鼠體重情況（n=8，g）

1.3 數據統計與處理

數據的統計分析應用SPSS24.0軟件，結果用x±s表示，兩組組間比較采用T-test，多組組間比較采用one-way ANOVA，P＜0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的體重在給藥前后的變化

第1 d，各組大鼠的體重基本相同。在進行造模后，同佐劑組比較，各模型組大鼠的體重增長明顯緩慢，均存在顯著性差異（P＜0.001）。給藥后，模型對照組體重開始下降，與佐劑組比較有顯著性差異（P＜0.001）；陽性藥組和低中高劑量組體重有明顯上升趨勢，與模型對照組相比，有顯著性差異（P＜0.001）（圖1）。

2.2 給藥前后RNS衰減變化

給藥后，在不同頻率的電刺激下，各模型組RNS衰減率有不同程度的衰減，其中衰減率最高的是模型對照組，佐劑組與其相比有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001）。各給藥組與模型對照組相比，在3 hz刺激下，陽性藥物組和低中高劑量組RNS衰減率均明顯下降，存在顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001）；在5 hz刺激下，陽性藥組和中高劑量組RNS衰減率均明顯下降，存在顯著性差異（P＜0.05，P＜0.001），低劑量組沒有顯著性，但是RNS衰減率呈下降趨勢；在10hz刺激下，陽性藥物組和低中高劑量RNS衰減率明顯下降，存在顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001）（圖2）。

圖2 給藥后大鼠RNS衰減率變化（n=8）

表2 給藥后大鼠血清中Achr-ab和IL-10含量變化

2.3 給藥后大鼠血清Achr-ab，IL-10含量變化

給藥后，模型對照組大鼠與佐劑組相比，血清中Achr-ab含量明顯升高，有顯著性差異（P＜0.001）。各給藥組與模型對照組比較，AChR-Ab含量均明顯下降，有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）其中陽性藥物組和高劑量組血清中Achr-ab濃度下降最顯著；模型對照組與佐劑對照組相比，血清中IL-10含量明顯降低，有顯著性差異（P＜0.001）；與模型對照組比，中高劑量組明顯上升，有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），陽性藥物組和低劑量組雖然IL-10濃度升高沒有顯著性，但是也處于上升趨勢（表2）。

2.4 給藥后大鼠胸腺組織中CD19蛋白表達情況

給藥后，模型對照組與佐劑組相比，CD19蛋白表達明顯上調，具有顯著性（P＜0.001）；陽性藥組和低中高劑量組與模型對照組相比，CD19蛋白表達均明顯下調，有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），其中低劑量組與模型組相比，蛋白表達下調最顯著,其顯著性為P＜0.001。陽性藥物組和黃芪中劑量組對CD19蛋白表達下調次之（P＜0.01）。黃芪高劑量組對CD19蛋白表達下調的影響相較于陽性藥物組和黃芪低中高劑量組較差，但與模型組比較也有顯著性（P＜0.05）（圖3）。

2.5 給藥后大鼠胸腺組織中CD19基因表達情況

給藥后，模型對照組與佐劑組相比較，CD19基因表達顯著上調（P＜0.01）；陽性藥和低中高劑量組與模型對照組相比，CD19基因均表達下調，有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.001）。黃芪低中高三個劑量組與陽性藥物組相比下調更加顯著，其中黃芪低劑量組下調結果最好（圖4）。

2.6 給藥后大鼠胸腺組織中IL-10基因表達情況

給藥后，模型對照組與佐劑組相比，IL-10基因表達顯著上調（P＜0.001）；陽性藥和低中高劑量組與模型對照組相比，IL-10基因表達均下調，有顯著性差異（P＜0.001）。其中陽性藥物組下調最明顯，但與黃芪低中高劑量組沒有明顯差異。

3 討論

圖3 給藥后大鼠CD19蛋白表達水平

圖4 CD19基因表達水平

MG的病變主要累及神經肌肉接頭（neuromuscularjunction，NMJ）處的AchR，其機制是在T細胞介導下，由B細胞產生AchR-Ab，與AchR結合并產生免疫應答反應，一方面通過引起肌肉正常細胞膜溶解而受到大量破壞；一方面可以使膜表面的交聯而增加退化速度[12]。B細胞通常聚集在淋巴器官的增生性胸腺中，這些結構的存在和頻率與AChR自身抗體呈正相關，反映了它們在AChR-Ab生成中的作用[13]。在免疫反應中，B細胞既可以起到正調節作用，又可以起到負調節作用[14]。

圖5 IL-10基因表達水平

一種B細胞的亞群分泌IL-10和轉化生長因子β（TGF-β）等免疫抑制因子，進而抑制免疫應答;這些細胞稱為調節性B細胞（regulatory B cell，Breg），Breg和B10細胞在各種疾病中發揮重要作用，參與疾病的發生、進展和預后，并參與的其他生理過程[15]。Breg除了產生自身的抗體外，還會分泌CK從而調節免疫反應[16]。基礎研究目前已確認Breg表型有：CD19+CD24+CD38+、CD19+CD5+CD1d+、CD19+CD24+CD27+、CD19+CD38+CD1d+IgM+CD147+、CD25hiCD71-hiCD73lo和CD27intCD38hi，而其中普遍認為最常見的表型是CD19+CD24+CD38+表型[17-18]。在MG患者中，總體的B細胞降低，但CD19+的B細胞亞群數量卻是升高的[12]。研究發現，與健康對照組相比，MG患者CD19+B細胞上BAFF-R的表達頻率明顯增加，Xiang Li等[19]認為B細胞成熟活化障礙是MG患者的表現。在本實驗中，胸腺中給藥后模型對照組CD19蛋白和基因的表達相較于佐劑組顯著上調，通過治療后，各給藥組基因和蛋白表達下調。

IL-10在自身免疫中的生理作用尚不完全清楚，最初被認為是一種小鼠的Th2細胞因子，抑制Th1細胞合成細胞因子[15]。后來的研究表明，IL-10在小鼠和人類中介導一系列免疫抑制和免疫刺激作用。同時IL-10也是B細胞重要的生長因子，促進B細胞增殖分化為抗體產生細胞，誘導B細胞的轉化[20]。人IL-10的產生并不局限于Th2細胞，因為Th0和Th1細胞，B細胞和巨噬細胞也被證明表達IL-10，且是B10細胞的特異標記。IL-10由B細胞產生，產生IL-10的B10是Breg細胞的一個子集，可以抑制T細胞和B細胞的炎癥免疫反應。研究發現B10細胞的生產伴隨著IL-10的mRNA轉錄，且證明了在AChR型MG患者中，CD4 T細胞增殖的B10細胞抑制能力與疾病的嚴重程度有關，提示B10細胞抑制T細胞不需要細胞間的接觸然而，當MG患者按疾病嚴重程度（眼∕輕度或中度∕重度）進行分類時，與輕度組相比，中度至重度組抑制CD4 T細胞增殖的能力較弱[21]。通常Breg細胞的抑制功能也是通過IL-10來測定[22]。B10細胞與自身免疫性疾病包括類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、原發性干燥性syn-drome、自身免疫性大皰性疾病、多發性硬化癥等相關，在部分疾病中，病人B10細胞頻率升高，雖不是在所有病例中都是這樣，但自身免疫性疾病患者的B10細胞頻率平均值明顯高于年齡匹配的健康對照組[14]。給藥后模型組血清中IL-10的含量顯著低于佐劑組，各中藥組和陽性對照組相較于模型對照組IL-10的含量增加。而胸腺中模型對照組基因的表達相較于佐劑組上調，在治理后各中藥組和陽性藥組相較于模型對照組下調。雖然對于模型對照組來說，血清中IL-10含量下降，胸腺中IL-10的表達增強，這樣看似矛盾，但這與最近國外在人體身上的研究結果是相同的[18,23]，研究表明在MG患者，IL-10的分泌下降，但基因表達上調。

益氣升提法是治療MG的重要方法，主要思路參考于張錫純的升陷湯和李東垣的補中益氣湯。黃芪，柴胡，升麻為代表的配伍是益氣升提法的主要配伍。黃芪為補氣之要藥。現代研究表明，黃芪有增強免疫力的作用[24]。黃芪多糖可以減少小鼠中CD4+T細胞，促進IL-10的分泌[25]。柴胡為少陽之藥，有升陽舉陷的作用。柴胡多糖對血漿中lgA、lgG、lgM的水平會起到增強作用，可以增強免疫力，治療自身免疫性疾病[26-27]。升麻具有升舉陽氣，清熱解毒的功效。現代藥理學研究表明升麻具有抗炎，抗血小板凝聚，抑制淋巴細胞增殖的作用[28-29]。

在本實驗中，各給藥組對MG均有良好的治療效果。其中黃芪中劑量組對血清中IL-10的改善最好，黃芪低劑量對CD19蛋白表達上調最佳。其它各組對各指標均有顯著改善，其中多組改善情況均強于西藥強的松。證明了益氣升提法通過調控B10細胞治療MG，加強自身免疫抑制，減輕其機體的免疫應答，調控淋巴細胞網絡因子，使機體恢復免疫平衡穩態，降低血清中Ach R-Ab水平，減輕NMJ處Ach R損傷，緩解臨床癥狀，從而達到治療效果。