藜蘆甾體生物堿抗腫瘤活性研究進展＊

李文希，張 屏，李福全，張 烜，岳 鑫，包保全＊＊

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 呼和浩特 010110；3.呼倫貝爾市蒙醫(yī)醫(yī)院 呼倫貝爾 021000）

蒙藥“阿格希日嘎”，中文名藜蘆，為百合科植物藜蘆Veratrum nigrum L.的干燥根及根莖，味苦、辛，性平，有毒，具有瀉下、催吐之功效，用于治療“希拉”病、消化不良、鐵垢巴達干，痞癥等[1]。本品來源于內(nèi)蒙古野生藜蘆屬植物藜蘆V.nigrum，主產(chǎn)于呼倫貝爾盟、哲里木盟、赤峰、錫林郭勒盟和烏蘭察布盟；其它兩種藜蘆，毛穗藜蘆V.maackii，主產(chǎn)呼倫貝爾盟（鄂倫春自治旗大楊樹），興安藜蘆V.dahuricum，主產(chǎn)于大興安嶺（白狼、克一河、寶格達山），也作為蒙藥藜蘆同等入藥[2]。藜蘆為蒙醫(yī)寒熱證總瀉藥，其中瀉痞為其主要功效之一。根據(jù)蒙醫(yī)傳統(tǒng)理論，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床診斷的很多腫瘤和癌癥都屬于蒙醫(yī)所界定的痞塊癥。本文對蒙醫(yī)藥古文獻中以藜蘆為主藥的方劑進行了整理，共收集36個方劑，包括劑型、功效主治、組方及出處信息，它們均具有清瀉體內(nèi)邪氣和病理產(chǎn)物之功效，其中用于瀉痞的方劑有8個。該研究為蒙藥藜蘆治療腫瘤及抗腫瘤制劑的開發(fā)提供文獻依據(jù)。

藜蘆屬（Veratrum）為百合科（Liliaceae）植物，全世界約有四十種，分布于亞洲、歐洲和北美洲，《中國植物志》載有13種1變種，廣泛作為藥用[3]。本屬植物的化學(xué)成分包括甾體生物堿類、二苯乙烯類、黃酮類、二肽類及其它，其中甾體生物堿為主要藥效活性成分，具有顯著的生理效應(yīng)，例如抗腫瘤、抗病毒、增強心肌收縮力、降血壓等[4]。目前，已分離得到甾體生物堿70余種，其結(jié)構(gòu)分類、藥理作用及藥理毒理研究已有綜述報道[5-7]。本文總結(jié)了近10年來分離得到的新異甾體生物堿，及在化合物單體層面的抗腫瘤活性研究，包括在細胞水平上的抗腫瘤活性篩選、化合物結(jié)構(gòu)修飾、構(gòu)效關(guān)系及作用機制等，為藜蘆及其制劑抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制、新藥研發(fā)提供參考。

1 藜蘆（阿格希日嘎）蒙醫(yī)方劑總結(jié)

蒙藥藜蘆為寒熱癥總瀉藥[8]，在蒙醫(yī)臨床中用于瀉下、脈瀉、鼻瀉、導(dǎo)瀉和催吐療法，治療“希拉”病、消化不良、痞塊、鐵垢巴達干，劍突痞，痧癥，蟲癥，疫熱，胎衣不下，水腫，瘡疽等。蒙醫(yī)理論認(rèn)為，痞塊癥系人體某部位，由惡血、黃水等聚集凝結(jié)而形成之痞塊的總稱，多屬于繼發(fā)各種病患的郁結(jié)性痼疾，可發(fā)生于人體各器官，包括食痞、血痞、赫依性痞塊、希拉性痞塊、膿痞和水痞等[9]。目前，蒙醫(yī)臨床用于治療痞塊癥（包括各種腫瘤和癌癥）的藥物主要為“破痞去滯”和“瀉痞”類蒙藥，且臨床療效明顯。本文從內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥博物館“蒙醫(yī)藥古文文獻全文檢索數(shù)據(jù)庫”中收集到以藜蘆為主藥的蒙藥瀉下方劑36個，對其劑型、功效主治、組方及出處信息列于表1。其中明確用于瀉痞的方劑有8個，列于表格第一部分，包括阿格希日嘎-4（清希拉、瀉痞）、肝病緩瀉劑（瀉肝熱、肝硬化）、巴達干瀉劑（瀉巴達干腫塊）、阿格希日嘎-3（瀉包如病積聚引起的痞塊）、瀉痞劑（破痞、瀉下）、抑黏紅丸（血瘀、痞證）、斑蝥七味丸（脈瀉、破痞）、斑蝥九味丸（脈瀉、破痞）。表格中還收集了瀉“希拉”、清熱方劑7個；殺黏、清瘟、瀉毒方劑10個，其它瀉肝熱、“赫依”、包如等10個；催吐方劑1個。這些方劑的整理為蒙藥藜蘆的瀉下應(yīng)用，尤其是“瀉痞”作用提供了依據(jù)，極有可能從中找到抗腫瘤活性物質(zhì)，開發(fā)出新型蒙藥抗癌制劑。

表1 蒙醫(yī)藥古文文獻中藜蘆（阿格希日嘎）的方劑總結(jié)

續(xù)表1

2 藜蘆甾體生物堿化學(xué)成分研究進展

藜蘆屬植物中甾體生物堿種類非常豐富，其基本骨架由27個碳組成，甾體部位可分為膽甾烷型和異膽甾烷型兩類，膽甾烷型生物堿又可分為茄次堿型（solanidine type）和維藜蘆堿型（verazine type），異膽甾烷型又可分為西藜蘆堿型（cevine type）和介藜蘆胺型（jervine type）[10]，其結(jié)構(gòu)母核見圖1。

從藜蘆屬植物中分離得到的甾體生物堿有70余種[6]，近年又從中分離得到13種新的甾體生物堿。Yue Cong[11]等，2008年從黑藜蘆Veratrum nigrum L.中分離得到1種新的生物堿，命名為12-βhydroxylveratroylzygadenine(1)。Veselin Christov[12]等，2010年從黑藜蘆Veratrum nigrum L.中分離得到1種新的生物堿，命名為(±)-15-O-(2-Methylbutyroyl)germine(2)。William Jia等[13]，2010年從黑藜蘆Vertrum nigrum L.根及根莖分離得到2種新的生物堿，分別命名為neoverapatuline(3)和(1β,3α,5β)-1,3-dihydroxyjervanin-12-en-11-one(4)。Yun Sun等[14]，2012年從大理藜蘆Veratrum taliense中分離得到3種新的生物堿，分別命名 為3-O-acetylveralkamine(5)、veralkamine 3-(β-Dglucopyranoside)(6)和6,7-epoxyverdine(8)。湯建等[15]，2008年從興安藜蘆Veratrum dahuricum的根及根莖中分離、鑒定了甾體生物堿26個，包括5種新的甾體生物堿，分別命名為14α-羥基-△11-環(huán)杷明(9)、3-乙酰基-15-當(dāng)歸酰基計明堿(10)、3，7-二乙酰基-15-當(dāng)歸酰基計明堿(11)、3-藜蘆酰基計明堿(12)、3-藜蘆酰基-15-當(dāng)歸酰基計明堿(13)。

3 藜蘆甾體生物堿抗癌活性研究進展

圖1 藜蘆屬中甾體生物堿的基本骨架類型

Yun Sun等[13]，2010年從大理藜蘆Veratrum taliense中分離得到的8種甾體生物堿，采用MTT法進行體外抗腫瘤活性測定中發(fā)現(xiàn)，新化合物3-Oacetylveralkamine（5）對所測試的五種人腫瘤細胞系，即HL-60、SMMC-7721、A-549、MCF-7和SW480均有顯著的抑制作用，IC50值分別為10.02,17.05,16.51,6.40和5.61μmol·L-1。新 化 合 物veralkamine 3-(β-Dglucopyranoside)（6）和已知化合物藜蘆卡明（7）對除SMMC-7721以外的四種腫瘤細胞系有顯著抑制作用，IC50值 分 別 為4.07、21.01、13.48、19.04μmol·L-1和10.60、19.08、8.29、11.53μmol·L-1。

Jian Tang等[16-17]，2008-2010年間，從興安藜蘆Veratrum dahuricum根莖中分離得到總生物堿及甾體生物堿類化合物，對其進行體外抗腫瘤活性檢測，結(jié)果表明藜蘆總生物堿對A-549、PANC-1、SW1990和NCI-H249這4種腫瘤細胞系均有一定的抑制活性，并且后續(xù)分析表明，介芬胺類生物堿占總生物堿總含量的60-65%，進而推測介芬胺類生物堿很可能是藜蘆提取物抗腫瘤活性的活性成分。介芬胺類化合物環(huán)杷明（14）對PANC-1、SW1990和NCI-H249三種癌細胞株均有顯著的抑制作用，其中對NCI-H249的抑制作用最強(IC50=14.4μmol·L-1）。同時環(huán)杷明對腫瘤細胞株A-549、LOVO和QGY-7703也表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，其IC50值分別為：38.36、40.16、88.36μg·mL-1。藜蘆胺（16）顯示出與環(huán)巴胺類似的細胞毒性，并且對人腫瘤細胞系A(chǔ)549、Aspc-1、PANC-1、SW1990、NCIH249、LOVO、QGY-7703和6T-CEM均表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤作用，其IC50值分別為8.9、79.6、14.5、26.1、23.23、35.35、15.32μmol·L-1。但介芬胺的葡萄糖苷偽介芬胺（26）和藜蘆胺的葡萄糖苷藜蘆托素（17），對這四種腫瘤細胞系的IC50值均大于100μg·mL-1；西藜蘆堿類化合物中除15-當(dāng)歸酰基計明堿（21）對6T-CEM瘤株有中等抑制作用（IC50=38.74μg·mL-1）外，3,15-二當(dāng)歸酰基計明堿（22）、當(dāng)歸酰基棋盤花胺（23）、藜蘆酰基棋盤花胺（24）、計明堿（25）對四種腫瘤細胞系均無顯著細胞毒活性。計明堿（25）對SW1990和NCI-H249細胞系比較敏感，其IC50值分別為47.2和24.1μmol·L-1，而對A549和PANC-1細胞系無明顯的抑制作用，這是首次發(fā)現(xiàn)西藜蘆堿類生物堿能夠選擇性抑Hh信號通路依賴性細胞SW1990和NCI-H249，需要進一步的研究來證實計明堿的抑制活性。

Yue Cong[13]等，2010年從黑藜蘆Veratrum nigrum L.的根及根莖中分離得到一種新的生物堿和四種已知生物堿類化合物，其中新的生物堿12β hydroxylveratroylzygadenine（1）和已知生物堿介芬胺（17）、藜蘆酰棋盤花堿（30）對人HL-60細胞系均具有顯著的抑制效果，其IC50值為52.67、52.90、56.51μmol·L-1。

4 藜蘆甾體生物堿構(gòu)效關(guān)系及微生物代謝研究

郭修晗等[18]，2015年以藜蘆胺（16）為原料，通過在藜蘆胺的哌啶環(huán)相應(yīng)位置引入修飾基團的方法，增加構(gòu)象限制，設(shè)計合成三種藜蘆胺類衍生物（18）、（19）、（20）。采用MTT法對所得到的化合物對于人胰腺癌ASPC-1細胞和人胃癌SGC-7901細胞的體外抗腫瘤細胞增殖活性進行評價。相應(yīng)產(chǎn)物（18）、（19）、（20）具有同對照品環(huán)巴胺相似或略強的活性，化合物（18）和（19）對ASPC-1的活性明顯優(yōu)于原料藜蘆胺及對照品環(huán)巴胺，化合物（19）在對人胰腺癌ASPC-1細胞和人胃癌SGC-7901細胞的IC50分別為18.8μmol·L-1和38.2μmol·L-1。初步構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果表明，在藜蘆胺的哌啶環(huán)上引入煙酸及對硝基苯甲酰基團等修飾基團可顯著提高藜蘆胺F環(huán)的抗腫瘤活性，環(huán)巴胺是一種選擇性抑制Hedgehog信號通路的甾體生物堿，具有顯著的抗腫瘤活性，介芬胺為環(huán)巴胺的11氧代衍生物在藜蘆中含量較高。兩者雖然結(jié)構(gòu)相似，但介芬胺的抗腫瘤活性明顯弱于環(huán)巴胺[19]。2015年，鄭曉紅等[19]為研究環(huán)巴胺類似物抗腫瘤作用的構(gòu)效關(guān)系，以介芬胺為原料進行結(jié)構(gòu)修飾，采用選擇性還原、甲基化及氧化反應(yīng)合成了環(huán)巴胺及8個類似物。運用MS、NMR對產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)表征，以MTT法研究產(chǎn)物對人胰腺癌ASPC-1和人胃癌SGC-7901細胞體外增殖的抑制作用，結(jié)果表明介芬胺的三種還原產(chǎn)物中只有環(huán)巴胺顯示了良好的抑制活性，而其它兩個還原產(chǎn)物的抑制活性與介芬胺類似，說明11位的取代基與化合物的抗腫瘤活性密切相關(guān)，當(dāng)11位為亞甲基時抗腫瘤活性較強，羥基和羰基均降低活性。此外，在氧化產(chǎn)物和甲基化產(chǎn)物中，只有化合物(32)對ASPC-1和SGC-7901兩種細胞均具有較好的抑制活性，其IC50分別達到66.68和66.31μmol·L-1，表明3位羥基的氧化可能會增強化合物的抗癌活性。

圖2 藜蘆屬中甾體生物堿的代表性化學(xué)結(jié)構(gòu)

Mohammed A.Khanfar[20]對異甾體類生物堿對人轉(zhuǎn)移性前列腺癌PC-3細胞系的增殖和遷移的能力進行研究發(fā)現(xiàn)，C-3β-糖苷化（26）以及5α-△5,6（20）還原后對PC-3細胞系的細胞毒性降低。藜蘆胺（16）的微生物代謝物（30）在10μmol·L-1濃度下顯示出良好的抗增殖活性，表明藜蘆醚通過C-3氧化成酮后活性增強，與△5,6遷移至△4,5有關(guān)，這種化學(xué)修飾可以彌補E環(huán)開放造成的活性損失。在傷口愈合測定中發(fā)現(xiàn)偽介芬胺和二氫介芬胺的抗遷移活性不好，表明C-3β-糖苷化或△5,6還原會對抗遷移活性產(chǎn)生不利的影響，具有△1,2和△4,5的C-3氧化成酮的藜蘆胺微生物代謝產(chǎn)物（31）顯示出對前列腺癌PC-3細胞系最有效的抗遷移活性。表明甾體生物堿的藥理活性與其母核結(jié)構(gòu)和取代基之間存在著密切的關(guān)系。

5 藜蘆甾體生物堿的抗癌機制研究

5.1 Hedgehog信號傳導(dǎo)途徑

現(xiàn)階段學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為，環(huán)巴胺在脊椎動物中抗腫瘤作用與Shh基因介導(dǎo)的hedgehog信號通路有關(guān)，當(dāng)該通路過度激活時會影響腫瘤的形成過程[21]。張萍萍[22]等人利用劃痕試驗表明，環(huán)巴胺可顯著降低HEC-1A細胞的遷移能力（P＜0.05），同時也反映出環(huán)巴胺可削弱人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。1980年，Hedgehog基因由Nusslein-Vollhard和Wieschaus在研究果蠅的基因突變時發(fā)現(xiàn)，Hh信號對腫瘤的形成和生長具有重要作用，細胞特異性的組織增生主要由Hh基因在不同組織中的過度表達和靶基因突變導(dǎo)致，并參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[23]。

5.2 Caspase-3依賴性細胞凋亡

丁婧[24]等研究結(jié)果表明，環(huán)巴胺體外給藥能促進AIA軟骨細胞的增殖，并抑制AIA軟骨細胞的過度凋亡，該抗凋亡作用和提高Bcl-2 mRNA表達，并降低Bax、Caspase-3 mRNA表達密切相關(guān)。Caspases（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）是半胱氨酸蛋白酶家族，在啟動和執(zhí)行細胞凋亡（程序性細胞死亡）中發(fā)揮重要作用[25]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3是caspase家族的一員，是細胞凋亡的主要下游介質(zhì)，被認(rèn)為是caspase的主要執(zhí)行者[26]。作為各條凋亡通路作用的樞紐、細胞凋亡的執(zhí)行者的Caspase-3，可使細胞結(jié)構(gòu)的全面解體，而抑制Caspase-3酶活性或拮抗Caspase-3功能可使細胞凋亡受抑制[27]。

5.3 細胞周期

孫全武[28]等研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路阻斷劑環(huán)巴胺對DU145細胞增殖的抑制作用，流式細胞術(shù)檢測環(huán)巴胺對DU145細胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，環(huán)巴胺可以抑制DU145細胞的增殖能力，其機制可能與下調(diào)DU145細胞cyclin E mRNA表達水平，從而將DU145細胞阻滯于G1期有關(guān)。張萍萍[22]等利用對細胞周期檢測結(jié)果證實了環(huán)巴胺具有可阻滯HEC-1A細胞周期運轉(zhuǎn)，使其停滯于G0∕G1期，從而抑制HEC-1A細胞增殖的作用。人們通過對酵母細胞和哺乳動物細胞的研究發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)控系統(tǒng)由兩類蛋白家族構(gòu)成，一類被稱為周期素（Cycin），已發(fā)現(xiàn)的周期素有CycinA、B、C、D、E等，它們分別作用于細胞周期的不同階段。另一類稱為細胞周期素依賴激酶（cyclindependentkinase，CDK），細胞通過對CDK的正負調(diào)控作用來維持自身增殖分裂的平衡，其中P21、P27、P16等能使CDK失活，為其負調(diào)節(jié)子，而細胞周期素能激活CDK，是CDK的正調(diào)節(jié)子。

5.4 自噬

李雪等人[22]通過利用流式細胞術(shù)及Western blot法進行檢測，研究結(jié)果顯示：HEC-1A細胞經(jīng)環(huán)巴胺處理后，表達LC3B蛋白HEC-1A細胞的百分比明顯提高（P＜0.05），同時，細胞中的LC3B蛋白水平也顯著上升（P＜0.05），表明了HEC-1A細胞發(fā)生自噬可由環(huán)巴胺誘導(dǎo)，從而抑制癌細胞生長與存活。作為細胞保存生命活動動態(tài)平衡的重要途徑的細胞自噬過程，其主要包括細胞內(nèi)蛋白及細胞器的降解循環(huán)。根據(jù)已有研究結(jié)果證實，腫瘤發(fā)生與自噬失調(diào)存在明顯相關(guān)關(guān)系，通過利用引發(fā)自噬，腫瘤細胞可應(yīng)對惡劣環(huán)境，并維持、調(diào)節(jié)細胞存活或引發(fā)細胞凋亡[29]。

6 結(jié)論與展望

藜蘆屬植物品種多樣、分布廣泛、多做藥用，其中蒙藥藜蘆瀉痞療效確切，應(yīng)用歷史悠久，為現(xiàn)代抗腫瘤制劑的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。中藥藜蘆與蒙藥藜蘆在資源分布、功效主治、服用原則與配伍規(guī)律等方面有明顯差異，前期研究表明兩者在化學(xué)成分特征圖譜上差異顯著。特別是具有活性且有毒的甾體生物堿類成分，蒙藥藜蘆幾乎不含有中藥藜蘆的主要甾體生物堿成分，介芬胺和藜蘆胺[30]。近年來，不斷從藜蘆屬植物中分離得到新型的甾體生物堿，該類成分的抗腫瘤活性及作用機制日益得到闡明，其結(jié)構(gòu)修飾的研究也開始起步，為藜蘆及其制劑抗腫瘤藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制、新藥研發(fā)提供了一定的參考。然而，藜蘆甾體生物堿作為抗腫瘤藥物的使用也存在一些問題亟待解決。第一，該屬植物的介藜蘆胺類和西藜蘆堿類化合物已被發(fā)現(xiàn)具有較好的抗腫瘤活性，但茄次堿型及維藜蘆堿型化合物的抗腫瘤活性研究比較少見。第二，甾體生物堿的抗腫瘤作用與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而到目前為止有關(guān)構(gòu)效關(guān)系的研究較少。第三，目前對典型甾體生物堿的作用機制研究較多，很多甾體生物堿的作用機制仍未被闡明，可以結(jié)合分子網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來深入研究其活性機制及構(gòu)效關(guān)系。此外，可以結(jié)合蒙藥方劑學(xué)開發(fā)出藥物新劑型。因此，蒙藥藜蘆具有極高的研究價值和開發(fā)潛力，對其進行更深入的研究和探索，具有廣泛而深遠的意義。