蚯蚓糞中除臭細菌的篩選及分子鑒定

李 輝 龐建周 楊 超 李明星 張鑫雨 李雪菲

（1 衡水學院濕地保護與研究中心 河北 衡水 053000；.河北省農林科學院旱作農業研究所河北 衡水 053000；.衡水學院生命科學學院 河北 衡水 053000）

蚯蚓糞中含有大量的細菌、真菌和放線菌等微生物，能夠吸收和降解排泄物中的惡臭成分。許多發達國家很早就已經將蚯蚓糞應用于惡臭的治理當中[1、2]。本課題以新鮮蚯蚓糞為研究對象，利用蚯蚓糞除臭的特性，從蚯蚓糞中篩選出除臭菌，對得到的菌種進行分子生物學鑒定，構建系統發育樹并分析，為今后研究除臭微生物菌劑的制備提供理論依據和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。新鮮的蚯蚓糞采集于周邊蚯蚓養殖基地。

1.2 培養基[3～6]。脫硫菌選擇培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏2 g，NaCl.g，Na2S·9H2O.g，蒸餾水1 000 ml；固體培養基加瓊脂20 g/L。

除氨菌選擇培養基：葡萄糖5 g，NaCl.g，(NH4)2SO40.6 g，K2HPO4.g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O0.05 g，蒸餾水1 L；固體培養基加瓊脂20 g/L。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的富集和篩選[7～12]。將10.新鮮的蚯蚓糞分別加入到不同的液體選擇培養基中，震蕩30 min，于20℃恒溫箱培養5.得到富集菌液。將富集的菌液梯度稀釋，進行初篩。用2%硼酸來吸收培養基中釋放的氨，用凱氏定氮法測氨的含量。用亞甲基藍分光光度法測定硫化氫，在665 nm 波長下測其吸光度。

1.3.2 菌種的分子鑒定[13]。采用天根細菌基因提取試劑盒提取細菌基因，進行PCR 擴增。測序工作由北京賽默飛基因技術有限公司完成。將測定的基因序列進行比較，與相似性較高的菌株序列進行多重比較和系統發育樹構建，進行分析。

2 結果與分析

2.1 除臭菌的篩選。從蚯蚓糞中共分離純化得到4 株菌株，分別命名為CC2、CC5、CC6、CC9，其中除氨菌3 株，分別為CC2、CC5、CC9；脫硫菌1 株，為CC6。

2.2 除臭菌的16SrRNA 基因序列分析。如圖1 所示，CC2 與Pseudomonas sp.的遺傳進化距離最近，序列比對顯示二者16SrRNA 序列相似度達99.27%；與Pseudomonas aeruginosa的遺傳進化距離較近，二者16SrRNA 序列相似度達99.2%，初步鑒定CC2 除臭菌屬于Pseudomonas sp.。

如圖2 所示，CC5與Bacillus subtilis的遺傳進化距離最近，序列比對顯示二者16Sr-RNA 序列相似度達99.93%.與Bacillusvelezensis的遺傳進化距離較近，二者16SrRNA 序列相似度達97.8%，初步鑒定CC5 除臭菌是Bacillus subtilis。CC6 與Bacillus icheniformis的遺傳進化距離最近，序列比對顯示二者16SrRNA 序列相似度達99.97%；與Bacillus oryzaecorticis的遺傳進化距離較近，二者16SrRNA 序列相似度達99.93%，初步鑒定CC6 除臭菌是Bacillus cheniformis。CC9 與Bacillus sp的遺傳進化距離最近，序列比對顯示二者16SrRNA序列相似度達99.86%；與Bacillus thuringiensis的遺傳進化距離較近，二者16SrRNA 序列相似度達99.65%，初步鑒定CC9 除臭菌屬于Bacillussp.。

圖1 CC2 菌株系統發育樹

圖2 CC5 菌株 CC6 菌株和CC9 菌株系統發育樹

3 結論

本試驗僅對除臭菌進行了初步篩選，共篩選得到4 株具有除臭效果的細菌：CC2、CC5、CC6 和CC9。其中CC2、CC5、CC9 是除氨菌，CC6 是脫硫菌。經16SrDNA 分子鑒定可知：CC2 菌株是Pseudomonas sp.，CC5 菌株是Bacillus subtilis，CC6 菌株是Bacillus icheniformis，CC9 菌株是Bacillus sp.。目前，正在對這幾株菌的除臭效果進行比較研究，并對這幾株菌的除臭條件進行研究，為后續制備除臭菌劑提供理論基礎和理論依據。