HPLC法評價儲存溫度對茶葉中3種兒茶素含量的影響

趙玥琪 郝婧瑋 王穎

關鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）;儲存溫度;兒茶素;表兒茶素;表沒食子兒茶素沒食子酸酯

我國是世界上最早發現和應用茶葉的國家，在古代，很早就有神農嘗百草，得荼而解之的傳說，其中荼就是茶葉[1]，而綠茶正是受大家歡迎的茶葉之一。由于產地、采摘季節及采摘要求、加工方式等的不同，茶葉的種類很多。從大類上可以分為白茶、綠茶、紅茶、普洱茶、烏龍茶等，其中綠茶主要是以茶樹的新葉和枝芽為原料，未經過任何發酵工序，但經過一系列殺青、整形、烘干等典型工藝過程制作而成的茶葉。

綠茶中含有大量的兒茶素（C）、咖啡堿以及少量的葉綠素、維生素、氨基酸等營養成分。兒茶素是類黃酮化合物[2]，它具有抗氧化[3]、抗菌消炎、抗病毒、預防癌癥[4]以及調節免疫系統、降血脂、降膽固醇等一系列藥理作用。

隨著研究的深入和新產品的不斷開發，綠茶中的兒茶素在食品、日用化妝品、精細化工、醫藥保健等不同領域得到了廣泛的應用[5]。茶葉的主要功能性成分是茶多酚（TP），它是茶葉中主要抗氧化物質，約占茶葉干質量的15%～45%。茶多酚中大部分為黃烷醇，通常稱之為兒茶素[6]，兒茶素是一種復合化合物，也是茶樹次生代謝物的重要組成成分，使茶葉充分發揮了其保健功能。它由多種單體物質構成，目前已確認的單體就有20多種。兒茶素主要的有效成分有4種，分別是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）[7]。在兒茶素類物質中表沒食子兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素沒食子酸酯為主要有效成分，其中EGCG含量最高，占兒茶素總含量的50%左右[8]。茶葉中各有效成分的結構見圖1。

兒茶素是構成綠茶功效和品質的必不可少的化學成分，它的含量決定了綠茶品質好壞，所以對兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯的提取進行研究，將有助于天然抗氧化劑的開發。茶葉在儲存期間，其內含物質受環境的影響，會發生各種各樣的變化，從而導致茶葉的感官質量指標降低。幾十年來，許多科學家對兒茶素的基本特性、組成及其基本的生化動態和檢測方法等開展了研究并獲得了不少的成就，為茶葉生化研究奠定了基礎[9-13]。許多研究表明，酯型兒茶素是茶葉抗癌的重要組分[14-16]，可抑制癌細胞生長和誘導癌細胞分化和凋亡，具有很強的抗癌作用，并具有很強的抗氧化、抗輻射、抗突變、抗高血脂、降血壓、抗血小板凝集、抗糖尿病、抗過敏和降低香煙毒害、除臭、殺菌、抑制病毒等功效，是茶多酚具有生理活性和廣闊用途的關鍵組分[17-18]。酯型兒茶素影響著茶葉飲料的品質[19-20]。

本試驗以綠茶為原料，利用高效液相色譜（HPLC）法對其在不同儲存溫度條件下兒茶素的含量進行比較研究，以期為探求綠茶儲存的最適宜溫度提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用的是超市隨機購買的綠茶。無水乙醇、色譜級甲醇（沈陽市民聯化工有限公司）;超純水;蒸餾水;2695高效液相色譜儀、C18色譜柱[沃特世科技（上海）有限公司];GM-0.33A隔膜真空泵（天津市津騰實驗設備有限公司）;SB-5200DTN型臺式數控超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技有限股份公司）;臺式離心機（美國貝克曼公司）;電子天平（上海天美天平儀器有限公司）;恒溫干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司）;25 mL量筒;50 mL錐形瓶;25 mL燒杯;離心管;玻璃棒;電熱恒溫水浴鍋;100、1 000 μL移液槍;進樣瓶;抽濾瓶;移液管。

1.2 試驗方法

本試驗利用高效液相色譜法研究不同儲存溫度對茶葉中兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯以及表兒茶素含量的影響。

1.2.1 樣品溶液的制備 取2.000 0 g茶葉置于不同的溫度（-15、-5、5、15、35、55、75、95 ℃）下放置5 d，然后將其分別置于50 mL錐形瓶中，分別加入配制好的甲醇溶液 20 mL，用玻璃棒充分攪拌均勻后，移入超聲波清洗機中，超聲提取30 min。取出錐形瓶，冷卻至室溫后，用移液槍吸取浸提液于量筒中，全部吸取后測其體積，分別進行記錄。用移液槍分別取不同儲存溫度的浸提液1 mL于離心管中并標號，放在離心機中，在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，用移液槍取上清液于進樣瓶中，制得樣品。

1.2.2 色譜檢測條件 色譜柱：C18色譜柱，粒徑 5 μm，250 mm×4.6 mm;進樣量：10 μL;流動相：V甲醇 ∶ V水=15 ∶ 85;柱溫：30 ℃;檢測波長：278 nm;檢測器：2998PDA紫外檢測器。每次檢測完成后，系統平衡30 min，重復進樣，并計算峰面積。

1.2.3 標準曲線的繪制 兒茶素標準曲線的繪制：配制0.1～3.2 mg/mL不同濃度的兒茶素標準溶液，以等度的條件放置在高效液相色譜儀中，測定不同溶液濃度情況下兒茶素的積峰面積。以積峰面積為縱坐標，兒茶素濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯標準曲線的繪制：配制0.1～3.2 mg/mL不同濃度的沒食子兒茶素沒食子酸酯標準溶液，以等度的條件放置在高效液相色譜儀中，測定不同溶液濃度情況下沒食子兒茶素沒食子酸酯的積峰面積。以積峰面積為縱坐標，表沒食子兒茶素沒食子酸酯濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

表兒茶素的標準曲線的繪制：配制0.1～3.2 mg/mL 不同濃度的表兒茶素標準溶液，以等度的條件放置在高效液相色譜儀中，測定不同溶液濃度情況下表兒茶素的積峰面積。以積峰面積為縱坐標，表兒茶素濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 精密度試驗 取同一份樣品試液，連續進樣5次，測得兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素的峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為130%、0.82%、1.50%，表明儀器精密度良好。

1.2.5 重復性試驗 精確稱取6份質量為0.5 g的茶葉樣品，并按“1.2.1”節中的方法制備供試品溶液，取10 μL進樣，測得兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素3種單體的平均含量分別為0.56%、2.82%、2.03%，RSD分別為1.3%、1.4%、1.6%，說明這種操作方法重復性良好。

1.2.6 穩定性試驗 取樣品溶液配制成濃度為對照品溶液80%、100%、120%（分別為低、中、高濃度）的溶液，分別在0、6、12、18、24 h進樣分析。結果表明，兒茶素低、中、高3種濃度峰面積RSD分別為1.2%、1.3%、1.3%，表沒食子兒茶素沒食子酸酯低、中、高3種濃度峰面積RSD分別為1.3%、1.8%、1.4%，表兒茶素低、中、高3種濃度峰面積RSD分別為1.3%、1.8%、1.5%，表明樣品溶液放置24 h穩定，能夠滿足測定要求。

1.2.7 加樣回收率試驗 準備制備已知含量的樣品適量，精確稱量后，分別加入標準品適量，按“125”節溶液的制備方法，制備加樣供試品溶液，分別進樣6次，觀察3種單品（兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素）的峰面積，計算RSD及平均回收率，其平均回收率分別為99.17%、99.25%、99.22%，RSD分別為1.08%、1.22%、0.78%。

2 結果與分析

2.1 兒茶素的標準曲線建立

以積峰面積為縱坐標，兒茶素含量為橫坐標，二者的線性回歸方程為y=6.6×106x-28 835.8，相關系數r=1，說明兒茶素標準品在0.1～3.2 mg/mL 范圍內，峰面積與兒茶素含量呈良好的線性關系（圖2）。

2.2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯的標準曲線建立

以積峰面積為縱坐標，表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量為橫坐標，二者的線性回歸方程為y=1.3×107x-746 680.9，相關系數r2=0.999 9，說明表沒食子兒茶素沒食子酸酯標準品在0.1～3.2 mg/mL 范圍內，峰面積與表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量呈良好的線性關系（圖3）。

2.3 表兒茶素的標準曲線建立

以積峰面積為縱坐標，表兒茶素含量為橫坐標，二者的線性回歸方程為y=4.0×106x+166 618.3，相關系數r=0.999 6，說明表兒茶素標準品在0.1～3.2 mg/mL范圍內，峰面積與表兒茶素含量呈良好的線性關系（圖4）。

2.4 儲存溫度對茶葉中兒茶素含量的影響

由圖5可知，儲存溫度為5 ℃時，兒茶素的含量最多，為0.012 4 mg/g。隨著溫度的升高或降低，兒茶素的含量均呈現不同程度的下降趨勢。從5 ℃到 -15 ℃，兒茶素的含量從0.012 4 mg/g降為 0.006 7 mg/g;存儲溫度從5 ℃到15 ℃，兒茶素的含量從0.012 4 mg/g急劇下降為0.002 5 mg/g;從15 ℃到95 ℃，兒茶素的含量下降趨勢平緩，95 ℃時兒茶素含量為0.001 8 mg/g。

2.5 儲存溫度對茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量的影響

由圖6可知，儲存溫度在5 ℃時，表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量最多，為0.805 0 mg/g。隨著溫度的升高或降低，表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量均呈現不同程度的下降趨勢。從5 ℃到 -15 ℃，表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量從0805 0 mg/g降為0.625 6 mg/g， 從5 ℃到15 ℃，表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量從0.805 0 mg/g急劇下降為 0.215 7 mg/g;從15 ℃到95 ℃，表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量下降趨勢平緩，95 ℃時含量為 0.147 1 mg/g。

2.6 儲存溫度對茶葉中表兒茶素含量的影響

由圖7可知，儲存溫度為5 ℃時，表兒茶素含量最高，為0.154 7 mg/g。隨著溫度的升高或降低，表兒茶素的含量均呈現不同程度的下降趨勢。從5 ℃到 -15 ℃，表兒茶素的含量從0.154 7 mg/g降為 0.129 6 mg/g;從5 ℃到15 ℃，表兒茶素的含量從0.154 7 mg/g急劇下降為0.041 1 mg/g;從15 ℃到95 ℃，表兒茶素的含量下降趨勢平緩，95 ℃時含量為 0.026 6 mg/g。

3 討論與結論

儲存溫度從-15 ℃到95 ℃，兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯以及表兒茶素的含量呈先上升后下降的趨勢，其中，在5 ℃儲存溫度下含量最高，95 ℃下含量最低。本研究表明，隨著儲存溫度的升高，可導致其濃度和含量的差異。

儲存溫度對兒茶素提取率的影響如下。（1）儲存溫度升高可以加快傳質過程，有利于有效成分的溶出，短時間內即可達到固液均衡，從而提高兒茶素的浸提率[21-22];（2）儲存溫度的升高會加速兒茶素的氧化，使其有效成分含量降低，進而降低其產率[23]。由此可見，兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯以及表兒茶素的含量在其他條件相同的情況下，儲存溫度為5 ℃時達到最大值，之后隨著儲存溫度的增加逐漸降低，在儲存溫度為95 ℃時達到最小值。在日常的茶葉儲存過程中，應避免溫度過高或過低，以免導致茶葉中的有效成分含量降低。將茶葉避光保存在5 ℃左右條件下，其有效成分含量最高。本試驗中的研究方法簡單并且易于操作，所用的主要藥品甲醇為常規試劑，成本偏低，而且對環境污染較少，兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯以及表兒茶素的提取率也相對較高，表明本試驗中工藝方法有較高的市場應用前景和參考價值。

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