硒化多糖對黑鯛存活、免疫力和抗氧化性能的影響

肖金星 王磊 鄭剛

關鍵詞：黑鯛;硒化多糖;存活率;免疫力;抗氧化性能

硒（Se）已被證明是動物必需的微量元素，在機體的生長、免疫和抗氧化等方面具有重要作用[1-2]。硒在硬骨魚類的新陳代謝中發揮著重要作用，關于硬骨魚類的硒需求量已開展了大量研究[3-4]。膳食硒不足可導致魚類攝食率降低、生長緩慢、免疫力降低等，而膳食硒過量會導致飼料效率降低、抑制生長和生物毒性等[5-7]，因此，適量的膳食硒對魚類的生長至關重要。自然界中的硒分為有機硒和無機硒2種形式，與無機硒相比，有機硒具有較高的抗氧化性、硒保留率、消化率和生物可利用度，而且具有較低的毒性[8-10]。硒化多糖是一種新型的有機硒，具有較強的抗氧化性能[11-12]。研究表明，多糖經過硒化修飾可增強其抗氧化和抗凝血活性[13]。然而，目前關于硒化多糖作為水產養殖動物膳食硒源，對水產動物免疫力和抗氧化性能影響的研究較少。

黑鯛（Acanthopagrus schlegelii），具有廣溫、廣鹽性、抗逆性強、生長迅速、肉質好等優點，是人工養殖和沿海增殖放流的優良品種，市場前景廣闊[14-15]。黑鯛的養殖模式主要以海水網箱養殖和海水池塘養殖2種為主，隨著黑鯛養殖規模不斷擴大、集約化程度不斷提高及海水污染日益嚴重，黑鯛養殖細菌性、寄生蟲性、病毒性病害頻發[16]，給養殖生產造成了極大的經濟損失，而鑒于傳統藥物對食品安全和環境的危害，開發高效的新型安全免疫增強劑成為當務之急。攻毒試驗是免疫增強劑效果最直觀的反映方式。本試驗研究了硒化多糖對攻毒試驗后黑鯛存活率、免疫力和抗氧化性能的影響，為黑鯛飼料免疫增強劑的開發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 攻毒試驗設計

試驗用黑鯛幼魚由浙江省海洋水產研究所試驗場提供，養殖于浙江省海洋水產研究所西軒島試驗基地室內流水系統中。挑選體質健康、大小均勻、初始體質量為（13.00±0.20） g的黑鯛幼魚隨機分為6組，每組3個重復，每個重復25尾，放入容積為310 L（水體260 L）的玻璃纖維缸內微流水式飼養8周。海水經沉淀、過濾后使用，流速控制在 2 L/min，平均水溫為（27±1） ℃，鹽度26～29 g/L，溶解氧>5.0 mg/L。養殖試驗期間，試驗黑鯛分別投喂6組飼料（D1～D6），每天投喂2次，投喂時間分別為08：00和16：00，每次投喂至眼觀飽食狀態。

黑鯛經過8周的飼養試驗，每缸隨機選取10尾，腹腔注射培養24 h的副溶血弧菌液0.2 mL/尾，菌液濃度為5.5×108 CFU/mL，開展為期10 d的攻毒試驗，攻毒期間正常飼養。每日記錄各試驗組黑鯛死亡率。

1.2 飼料配方

基于筆者所在研究團隊前期黑鯛飼料營養需求研究結果，配制6組等氮等能飼料（D1～D6）。D1～D6組試驗飼料分別添加硒化多糖，使得試驗飼料中外源有機硒的添加量為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、3.0 mg/kg。硒化多糖由筆者所在實驗室自行制備，通過殼寡糖與亞硒酸鈉螯合而成，分子量為50 ku，硒含量的實測值為 17.7 mg/g。飼料原料粉碎過80目篩，充分均勻混合后，制成直徑為2.5 mm的硬顆粒飼料，采用空調抽濕、風扇干燥72 h，分裝標記后置于-20 ℃冰柜中保存備用。測定試驗飼料D1～D6中硒的含量分別為0.34、0.52、0.68、091、1.08、3.06 mg/kg。各組試驗飼料配方組成及營養成分值見表1。

1.3 樣品采集及分析測定

養殖試驗結束后，將試驗魚饑餓24 h后，采用MS-222（60 mg/L）麻醉，記錄每缸試驗魚數目，測量體長、體質量。所有試驗魚尾靜脈取血，置于離心管中，4 ℃靜置2 h，3 000 r/min 離心15 min，取上層血清，立即用液氮快速冷凍，然后保存于-80 ℃冰箱中，待分析用。

血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活力和MDA含量，采用南京建成生物工程研究所試劑盒檢測。

1.4 數據處理

本試驗結果數據均采用“平均數±標準差”（x±s）表示，用SPSS 16.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA）后采用Tukeys多重比較檢驗，顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 硒化多糖對攻毒試驗后黑鯛血清免疫力的影響

由圖1可知，在給黑鯛注射副溶血弧菌10 d后，隨著飼料中硒含量的增加，黑鯛血清溶菌酶（LZM）活性呈現升高的趨勢，飼料中硒含量為 3.06 mg/kg 的試驗組黑鯛血清LZM活性最高，顯著高于除飼料硒含量為0.91、1.08 mg/kg之外的其他各試驗組（P<0.05）。

2.2 硒化多糖對攻毒試驗后黑鯛血清抗氧化性能的影響

由圖2、圖3和圖4可知，在給黑鯛注射副溶血弧菌10 d后，隨著飼料中硒含量的增加，黑鯛血清超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活性均呈現升高趨勢，且均在飼料中硒含量為3.06 mg/kg的試驗組達到最大值，顯著高于飼料中硒含量為0.34、0.52和 0.68 mg/kg 的試驗組（P<0.05），但與飼料中硒含量為0.91、1.08 mg/kg的試驗組沒有顯著差異（P>0.05）。

由圖5可知，在給黑鯛注射副溶血弧菌10 d后，隨著飼料中硒含量的增加，黑鯛血清丙二醛（MDA）含量呈現降低的趨勢，在飼料中硒含量為3.06 mg/kg的試驗組達到最小值，顯著低于除飼料中硒含量為0.91、1.08 mg/kg之外的各試驗組（P<0.05）。

2.3 飼料中添加硒化多糖對攻毒試驗后黑鯛累積死亡率的影響

由圖6可知，在給黑鯛注射副溶血弧菌10 d后，黑鯛的累積死亡率隨著飼料中硒含量的增加呈現降低的趨勢，飼料中硒含量為1.08、3.06 mg/kg的試驗組黑鯛的累積死亡率最低，顯著低于除飼料中硒含量為0.91 mg/kg之外的各試驗組（P<005）。

3 討論與結論

3.1 飼料中添加硒化多糖對攻毒試驗后黑鯛免疫力的影響

魚類是特異性免疫和非特異性免疫并存的脊椎動物，但與哺乳動物相比，魚類特異性免疫機制還不完善，在抵御病原微生物時主要依賴非特異性免疫發揮作用[17]。溶菌酶通過引發溶菌反應和作為調理素發揮其抗菌活性[18-19]，是反映動物非特異免疫功能的重要生理指標。許多研究表明，免疫增強劑可以提高魚類血清溶菌酶的活力，例如陳興發研究發現，姜黃素可以提高羅非魚的血清LZM活力[20]。宋曉玲等將0.1%和1.0% 2種濃度的肽聚糖懸液注射入牙鲆體內，測定發現牙鲆血清溶菌酶活性顯著提高[21]。郭玉娟等研究發現，在飼料中添加250～450 mg/kg的肽聚糖可顯著提高彭澤鯽的血清溶菌酶活力[22]。硒能增強動物的體液和細胞免疫功能[23]，Low等將絲鰭毛足鱸暴露于含硒 05 g/m3 的水體2周后，發現絲鰭毛足鱸血漿溶菌酶活力升高33.72%[24]。本研究發現，飼料中添加硒化多糖可以顯著提高副溶血弧菌感染黑鯛的血清LZM活力，當飼料硒含量低于0.91 mg/kg時，黑鯛的血清LZM活力隨著飼料硒含量的增加顯著升高（P<0.05），當飼料硒含量高于0.91 mg/kg時，黑鯛的血清LZM活力不再顯著升高（P>0.05）。這可能是因為飼料硒不足時，補充膳食硒能夠提高黑鯛血清LZM活力，而膳食硒滿足黑鯛需求后，繼續補充膳食硒對黑鯛血清LZM活力沒有顯著影響。研究結果表明，硒化多糖能夠提高副溶血弧菌感染后黑鯛的免疫力，以增強其對副溶血弧菌感染的抵抗力。以免疫力為評價指標，黑鯛對飼料中硒的最適需求量為0.91 mg/kg。

3.2 飼料中添加硒化多糖對攻毒試驗后黑鯛抗氧化性能的影響

血清中SOD、CAT和GPx活性以及MDA含量是反映血清抗氧化能力的重要指標[25-27]。SOD可以催化超氧陰離子形成H2O2和O2[28]，隨后H2O2在GPx和CAT的作用下分解生成水和氧氣[29-30]。GPx、SOD和CAT被認為是細胞防御功能的第1道防線，GPx和SOD活性以及兩者之間的平衡對于抵抗氧化損傷具有重要的保護作用[31]。硒是GPx的重要組成部分[32]，GPx的活性與機體硒含量密切相關，在異育銀鯽[33]、鯉魚[34]，飼料中添加硒能顯著增加魚體GPx活力，且GPx活力與硒添加量呈正相關關系。MDA是脂質過氧化的產物，通常被作為檢測氧化損傷的重要指標[35]。Burhan等研究發現，適量添加亞硒酸鈉能使虹鱒血清MDA含量降低[36]。本研究中，隨著飼料中硒化多糖添加量的增加，當飼料硒含量低于0.91 mg/kg時，黑鯛幼魚血清SOD、CAT和GPx的活性與飼料硒含量呈現正相關（P<0.05），血清中MDA含量與飼料硒含量呈現負相關（P<0.05），而當飼料硒含量高于091 mg/kg時，黑鯛幼魚血清SOD、CAT、GPx的活性及MDA含量不再顯著變化（P>0.05），表明飼料中添加硒化多糖可以顯著提高副溶血弧菌感染黑鯛的血清抗氧化性能，且血清抗氧化能力與硒的添加量呈現正相關。以抗氧化性能為評價指標，黑鯛對飼料中硒的最適需求量為0.91 mg/kg。

3.3 飼料中添加硒化多糖對攻毒試驗后黑鯛累積死亡率的影響

攻毒試驗是免疫增強劑效果最直觀的反映方式。硒可以影響水生動物的疾病抵抗力，硒缺乏會降低動物的免疫功能，攝食缺硒飼料可使其疾病抵抗力降低，適當補充外源硒可以增強它們的免疫功能，從而增強其疾病抵抗力[37]。Wang等研究表明，斑點叉尾的抗病力與飼料硒水平密切相關，0.20 mg/kg 的硒代蛋氨酸和0.40 mg/kg的酵母硒可顯著提高斑點叉尾經愛德華氏菌攻毒后的存活率[38]。華雪銘等報道，添加劑酵母硒的含量與嗜水氣單胞菌對異育銀鯽的LC50密切相關，隨著添加劑酵母硒含量的升高，LC50升高，即異育銀鯽對嗜水氣單胞菌的抵抗力增強[39]。本研究中，在給黑鯛注射副溶血弧菌，經過10 d的攻毒試驗后，飼料中添加硒化多糖可以顯著降低黑鯛的累積死亡率，當飼料硒含量低于0.91 mg/kg時，黑鯛的累積死亡率隨著飼料硒含量的增加顯著降低（P<0.05），當飼料硒含量高于0.91 mg/kg時，黑鯛的累積死亡率不再顯著降低（P>0.05）。研究表明，硒化多糖可以提高黑鯛對副溶血弧菌感染的抵抗能力，提高養殖存活率，這可能是硒化多糖通過提高副溶血弧菌感染黑鯛的血清免疫力和抗氧化性能實現的。以副溶血弧菌感染后黑鯛的存活率為評價指標，黑鯛對飼料中硒的最適需求量為0.91 mg/kg。

綜上所述，飼料中添加硒化多糖可以提高副溶血弧菌感染黑鯛的免疫力和抗氧化性能，提升黑鯛對副溶血弧菌感染的抵抗能力，降低黑鯛感染副溶血弧菌后的死亡率，提升黑鯛養殖存活率。以副溶血弧菌感染后黑鯛的免疫力、抗氧化性能和存活率為評價指標，黑鯛對飼料中硒的最適需求量均為091 mg/kg。

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