噴淋秋水仙素加倍玉米單倍體籽粒最適條件及應用效果研究

孫成韜 劉曉麗 王延波

關鍵詞：玉米;噴淋法;加倍率;單倍體;秋水仙素

玉米常規方法育種選育自交系，周期比較長、速度比較慢，限制了玉米品種研發和更新速度。以玉米孤雌誘導系為基礎的雙單倍體（DH）育種技術可以有效地縮短育種年限，加快育種進程，為種質的改良和新品種的選育提供重要的技術支撐[1-2]。DH育種技術已經在國際多家單位中得到大規模的應用[3]，我國很多單位也相繼開展了單倍體育種技術研究和應用。

玉米單倍體育種技術已經成為國際研究熱點之一，隨著誘導基因的精細定位和機制的揭示，產生單倍體的理論基礎得以進一步明確，它已是培育玉米新材料和新品種的最高效的技術手段[3]。然而，單倍體自然加倍成二倍體比較困難，即加倍率低，目前加倍率達10%是很難實現的[4-6]。Wan等研究報道，許多玉米種質單倍體植株自然加倍率低于5%，有些種質甚至根本不發生自然加倍[7-8]。我國早期單倍體加倍以自然加倍為主，由于自然加倍率低不能滿足生產的需要，現階段主要以化學加倍為主。要獲得大量玉米DH系，才能達到選優的目的，必須借助單倍體人工染色體加倍技術體系。秋水仙素是目前應用較廣泛的染色體加倍藥劑之一，能有效地抑制細胞分裂過程中紡錘絲的形成，促使細胞染色體數目加倍，在玉米單倍體加倍中得到廣泛應用。關于玉米單倍體化學加倍技術和方法的報道較多[9-12]，人們對秋水仙素施用的濃度和方法進行了探索，主要有浸泡法、注射法或滴心法、噴淋法等。姜龍等研究的秋水仙素加倍甜玉米單倍體試驗表明，對玉米單倍體植株傷害較嚴重，有浸芽法和針刺生長點法，存活率不超過50%[13]。浸泡法由于泡在藥液中，時間短效果不明顯，時間長容易進行無氧呼吸降低成活率;注射法或滴心法需要大量的人工，人員長時間接觸秋水仙素不安全;而噴淋法操作簡便，自動化程度高，便于大規模應用，減少人員與秋水仙素的接觸時間。秋水仙素噴淋法的加倍效果如何，是否達到預期的目的需要進行驗證。

在借鑒和學習前人研究基礎上利用自制噴淋加倍設備，對秋水仙素噴淋單倍體幼苗的最佳加倍濃度和時長進行了研究，并在最適條件下研究了不同種質材料的噴淋加倍應用效果，為秋水仙素噴淋法加倍單倍體籽粒的應用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

組1：選用迪卡516（XL21×H2671）為母本，父本誘導系為遼誘1號，誘導產生的單倍體籽粒為試驗材料，研究秋水仙素噴淋處理玉米單倍體幼苗的最適濃度和時長。

組2：選用表1中不同種質材料為母本，父本誘導系為遼誘1×CAUHOI3的雜交種，誘導產生的單倍體籽粒為試驗材料，研究秋水仙素噴淋對不同種質的加倍效果。

1.2 試驗方法

試驗采用噴淋法：挑選后的單倍體籽粒先采用沙培法催芽，當幼苗芽長約2 cm時用剪刀將幼芽頂端胚芽鞘切掉（距離中胚軸5～10 mm），將幼苗裝入漏水的塑料筐內，放入噴淋秋水仙素的加倍設備中，如圖1所示，為了避免噴淋裝置上下層不均勻的問題，將該試驗的材料全部放在最上面的一層，加倍環境均勻一致。噴淋秋水仙素，然后換成清水進行噴淋洗苗。將其移栽至大田，用完全隨機兩因素3次重復設計。采用噴灌的方式移植大田，計算植株成活率;開花期套袋自交，收獲后計算加倍率。

植株成活率=成活單倍體株數/出苗的種子 數×100%;加倍率=自交結實的單倍體植株數/總單倍體植株數×100%。

試驗分2組進行。

組1試驗：2018年4月底在沈陽加倍處理，設置秋水仙素濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，設置噴淋時長分別為6、8、10、12、14 h。

組2試驗：2018年5月在沈陽，以11個不同種質材料為母本、孤雌生殖誘導系遼誘1×CAUHOI3的雜交種為父本誘導產生的單倍體籽粒為試驗材料，2018年11月在遼寧省農業科學院海南佛羅玉米育種基地（108°46′E、18°36′N）進行，秋水仙素濃度為0.625 mg/mL，噴淋時長為10 h，將11個基礎材料的單倍體籽粒分成2份，每份中設3次重復：一份進行直接播種，出苗后用剪刀減掉芽尖，噴淋適量清水;另一份出苗后剪掉芽尖后進行秋水仙素噴淋加倍處理。

1.3 數據處理

試驗數據在Excel 2007軟件中整理，方差分析用DPS 7.05統計軟件的雙因素、單因素方差分析和Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素噴淋法有利于提高幼苗的成活率

由表2可知，2018年秋水仙素噴淋濃度為 0.4 mg/mL、噴淋6 h的植株成活率最高，達 91.3%;秋水仙素濃度為0.6 mg/mL、噴淋6 h的植株成活率居第2位，為88.6%;秋水仙素噴淋濃度為1.2 mg/mL、噴淋14 h的植株成活率最低，為 62.7%。噴淋時長為6 h的幼苗成活率均值為 83.7%，噴淋時長為14 h的幼苗成活率均值為 68.5%;秋水仙素噴淋濃度為0.4 mg/mL的幼苗成活率均值為83.5%，秋水仙素噴淋濃度為 1.2 mg/mL 的幼苗成活率均值為68.8%。噴淋法有充足的氧氣供應，成活率下降較慢。

由表3可知，2018年單倍體幼苗平均加倍率與噴淋濃度的關系為：0.6 mg/mL>0.8 mg/mL>1.0 mg/mL>0.4 mg/mL>1.2 mg/mL;單倍體幼苗平均加倍率與噴淋時長的關系為：10 h>8 h>12 h>14 h>6 h。秋水仙素噴淋濃度為 0.6 mg/mL、噴淋10 h處理的單倍體幼苗加倍率為17.5%;秋水仙素濃度為0.6 mg/mL、噴淋8 h處理的單倍體幼苗加倍率為16.2%。試驗表明，秋水仙素噴淋濃度為0.6 mg/mL、噴淋時長為8～10 h的加倍效果較好。

由表4可知，噴淋秋水仙素的濃度和時長對加倍率的影響都達到了極顯著水平。濃度的方差為167.60，時長的方差為30.97，說明噴淋秋水仙素中時長效應小于濃度效應。

2.2 秋水仙素噴淋法的加倍效果比較明顯

由表5可知，2018年冬在海南的自然加倍率為0.55%～7.69%，秋水仙素噴淋的加倍率為 1.68%～21.33%，平均自然加倍率為2.46%，噴淋秋水仙素處理的平均加倍率為9.29%。P9的自然加倍率為7.69%，噴淋秋水仙素處理的加倍率最高，為21.33%，為對照的2.77倍;排在第2位的是P11，自然加倍率為3.03%，噴淋秋水仙素處理的加倍率為17.05%，為對照的5.63倍;最低的是P1，自然加倍率僅為0.55%，噴淋秋水仙素處理的加倍率為1.68%，為對照的3.05倍;第2低的是P2，自然加倍率為0.71%，噴淋秋水仙素處理的加倍率為 4.48%，為對照的6.31倍。在1%水平上，P9（SS-NSS種質）的差異只與P1（SS種質）的差異達到極顯著水平;在5%水平上，P9（SS-NSS種質）、P11（NSS種質）與P1（SS種質）差異顯著，說明秋水仙素噴淋加倍的效果明顯，但不同遺傳背景之間的自然加倍率差異較大，噴淋秋水仙素對所有試驗材料的加倍率都有提高作用。

2.3 秋水仙素噴淋法對不同種質的加倍效果不同

由表6可知，秋水仙素噴淋法加倍效果與直接播種自然加倍相比達到了極顯著水平，不同種質的遺傳特性在10%的水平上差異顯著，噴淋秋水仙素效應大于遺傳效應，自然加倍高的材料，秋水仙素處理后加倍率相對較高，存在一定的正相關。自然加倍率由高到低為SS-NSS種質、NSS種質、SS種質。

如圖2所示，秋水仙素噴淋法對單倍體籽粒加倍效果有明顯提高，是對照的1.54～9.44倍，為對照平均值的4.93倍。自然加倍率的平均值：SS-NSS種質（4.49）﹥NSS種質（2.38）﹥SS種質（148），噴淋秋水仙素加倍率的均值：NSS種質（16.67）﹥SS-NSS種質（10.98）﹥SS種質（598），噴淋秋水仙素加倍率的提高的倍數：NSS種質（6.00）﹥SS種質（3.04）﹥SS-NSS種質（145）。秋水仙素噴淋法對全部試驗材料都有提高作用，是一種有效的加倍方法，利用該噴淋設備加倍單倍體籽粒的方法簡便易行，安全性好。

3 討論與結論

3.1 單倍體籽粒自然加倍率低

單倍體自然加倍率已經在業內形成共識。王賀等研究單倍體自然加倍的情況發現，自然加倍率低于2.0%[14]。張坤明等研究表明，單倍體自然加倍率較低，僅為2.5%[15]。蔡泉等研究不同種質和不同地點對自然加倍率的影響，獲得的自然加倍率范圍為3.88%～9.94%[16]。王文潔等研究玉米單倍體籽粒在自然加倍條件下，顯花藥率可達12.7%～57.2%，但是單倍體結實率只有1.0%～7.2%，而且有些單倍體經過多次授粉后仍不能自交結實[17]。本研究中，2018年冬季海南不同種質的自然加倍結實率也比較低，僅為0.55%～7.69%，因此， 單倍體的自然加倍直接應用比較困難，急需研究有效的人工加倍技術。

3.2 處理加倍的成活率

試驗處理后的成活率是加倍率的基礎。文科研究浸種法、注射法浸根法和浸芽法的加倍效果，結果發現浸根法和浸芽法的植株受害情況比較嚴重[18]。姜龍等研究爆裂玉米單倍體加倍方法中，成活率分別為浸根法的25.6%～39.3%、浸芽法的48.4%～78.6%、滴心葉法的26.6%～54.8%、針刺生長點法的38.2%～59.6%，總體來看這些方法成活率較低[19]。劉曉鑫等研究不同種質用秋水仙素加倍中，成活率從89.3%下降到46.9%，下降比較明顯[20]。本研究采用秋水仙素噴淋法，保持了幼苗水分和氧氣的充足供應，不會出現厭氧的情況，成活率在62.7%～91.3%，成活率較其他方法明顯提高。

3.3 秋水仙素噴淋法效果

秋水仙素噴淋加倍率受到遺傳基礎的影響，存在一定的正相關。本研究結果表明，不同種質的玉米單倍體幼苗噴淋秋水仙素加倍效果明顯高于自然加倍率。試驗中噴淋秋水仙素加倍不同種質的加倍率為1.68%～21.33%，加倍率為對照的 1.54～9.47倍，秋水仙素噴淋法的加倍效果明顯、普遍適用。而且該方法操作簡便，減少人員對秋水仙素的接觸，廢液便于回收，有利于保護環境，有一定的推廣應用價值。

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