林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族轉錄因子的原核表達

趙位 喻東 程建國

關鍵詞：林麝;肺炎克雷伯氏菌;kp05372基因;原核表達

林麝（Moschus berezoviskii）為《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄Ⅱ和國家一級保護動物，其雄性分泌的麝香為名貴的中藥材和高級動物香料，具有重要的社會價值和經濟價值。人工養殖是林麝資源保護的主要對策之一，我國從1958年開始人工養殖林麝，歷經半個多世紀，發展仍較緩慢。影響林麝人工養殖的一個重要原因是林麝化膿性肺炎疾病的發病率和死亡率高[1]。林麝患化膿性肺炎后前期一般不易發現，發現時已經處于較嚴重階段，基本上無救治希望[2]。引起圈養林麝化膿性肺炎的病原菌種類繁多，包括大腸桿菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌、巴氏桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌等多種病原[3-4]。

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）屬于腸桿菌科克雷伯菌屬。自Friediander（1882年）首次從病人的肺組織中分離得到該菌后，在大熊貓、疣猴、金絲猴和林麝等多種珍稀動物體內均分離得到該菌[5-8]。該菌為條件性致病菌，在機體免疫力下降或長期使用抗生素導致菌群失調時，可引起人或動物感染肺炎、腦膜炎、肝膿腫、腸炎、腹膜炎等多種疾病[9]。在肺炎克雷伯氏菌基因組中分布著大量轉錄調節因子，其中LysR家族轉錄因子是最大的調節蛋白家族[10]，其調控的目的基因參與了細菌的毒力、新陳代謝、運動性、抗氧化、黏附和分泌等[11]。前期研究中，課題組在患化膿性肺炎和腹瀉林麝的腸道中分離出1株肺炎克雷伯氏菌，該菌株對小鼠具有強致病性，全基因組測序分析發現，該菌株基因組序列中有1段序列大小為909 bp的編碼序列（登錄號：KX026659），命名kp05372，通過生物信息學方法分析發現，該基因為1個新的LysR家族轉錄因子，可能具有LysR家族轉錄因子相似的功能[12]。因此，本研究擬通過對該基因進行原核表達，以期為該基因的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與質粒

林麝源肺炎克雷伯氏菌菌株由筆者所在實驗室保存;感受態大腸桿菌DH5α和BL2（DE3），購自天根生化科技有限公司;克隆載體pMD19-T sample載體，購自大連TaKaRa公司;表達載體 pET-32a（+） 為筆者所在實驗室保存。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒及DNA Marker（DL2000）、DNA純化回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、Western Blot試劑盒;限制性內切酶KpnⅠ、EcoRⅠ、D2000 plus DNA ladder、Trans 2K plus ⅡDNA Marker、蛋白質Marker、DNA T4連接酶、PVDF膜、考馬斯亮藍R250、IPTG和2×SDS凝膠上樣緩沖液、抗His標簽單克隆抗體、二抗（兔抗鼠）等。

1.3 pMD19-T/kp05372重組克隆載體構建與鑒定

運用Primer 5.0和Oligo 6.0設計擴增kp05372基因的特異性引物（P1：5′-GGTACCATGAACGGGATCAGTTTCAACC-3′，下劃線堿基為KpnⅠ酶切位點;P2：5′-GAATTCTTAGCTGCGACGCTCCTG-3′，下劃線堿基為EcoRⅠ酶切位點）。以GPKP菌株DNA為模板，進行kp05372基因的PCR擴增。PCR反應體系為：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 mmol/L P1引物1.0μL，10 mmol/L P2引物 1.0 μL，DNA模板 10 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將擴增產物進行電泳、膠回收和測序，測序結果與目標序列進行比對、驗證，然后利用T4連接酶將其與pMD19-T載體16 ℃連接過夜，將連接產物轉化至E.coli DH5α感受態細胞中，然后取100 μL涂于含0.1 mg/mL氨芐青霉素（Amp）的LB培養基上，37 ℃恒溫培養16 h后，挑取單菌落分別接種于LB液體培養基中，37 ℃恒溫振蕩16 h。隨后分別提取質粒，以P1、P2為引物，進行PCR和用KpnⅠ、EcoRⅠ單、雙酶切驗證。

1.4 pET-32a（+）/kp05372重組表達質粒構建與鑒定

利用KpnⅠ和EcoRⅠ酶對重組克隆質粒pMD19-T/kp05372和表達質粒pET-32a（+）雙酶切。pMD19-T/kp05372質粒37 ℃酶切2 h，pET-32a（+） 質粒37 ℃酶切12 h，電泳分離酶切產物，然后膠回收目的片段，16 ℃連接過夜。連接反應體系如下：目的片段5.0 μL;pET-32a（+）片段1.0 μL;T4 Ligase 0.5 μL;T4 Ligase Buffer 1.0 μL;H2O 2.5 μL。最后將連接產物轉入感受態細胞E.coli DH5α，涂布于含0.1 mg/mL Amp的LB固體培養基，于37 ℃培養箱中培養12 h，分別挑取陽性克隆菌株，提取質粒進行PCR和KpnⅠ、EcoRⅠ單、雙酶切驗證，對鑒定正確的重組表達質粒送公司進行測序。

1.5 重組蛋白的誘導表達及條件優化

將pET-32a（+）/kp05372重組質粒陽性E.coli BL21（DE3）接種于含0.1 mg/mL Amp的LB液體培養基中，37 ℃溫度振蕩培養至D600 nm約為0.6，分別加入IPTG至終濃度為0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L，誘導培養4 h，各取菌液 1 mL。同時，取部分IPTG濃度為0.6 mmol/L菌液離心，收集上清，用Tris-HCl（pH值=8.0）洗滌沉淀，超聲波裂解菌體，離心，收集沉淀。同時，在IPTG濃度0.6 mmol/L組設置28、30、37 ℃溫度梯度及1、2、3、4、5、6、7、8、9 h的誘導時間梯度。最后，分別在0.6 mmol/L菌液上清、裂解上清、裂解沉淀、不同IPTG濃度菌液、不同誘導時間菌液、不同溫度梯度菌液沉淀樣品中，加入25 μL PBS和 25 μL 2×SDS凝膠上樣緩沖液，混勻后沸水煮 5 min，10 000 r/min 離心1 min，取10 μL上層液體SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍R250染色后脫色，利用凝膠成像系統分析目的蛋白的表達情況。同時，設置誘導的空載體pET-32a（+） BL21（DE3）轉化菌作為對照。