TBP分子標記技術的原理及應用研究進展

吳麗群 張延明 趙麗杰

關鍵詞：TBP;β微管蛋白基因;分子標記;遺傳多樣性;種質資源親緣關系

DNA分子標記技術因多態性高、檢測方法簡單、快速、表達產物不依賴于植物的發育階段和環境因素等優點，在作物遺傳連鎖圖譜構建、重要性狀基因定位與克隆、種質資源遺傳多樣性與系統發育分析、品種指紋圖譜繪制及遺傳純度檢測等方面應用廣泛[1-2]。遺傳多樣性是種內不同種群之間或一個種群內不同個體的遺傳變異程度。遺傳多樣性的評估對于研究生物多樣性、種群動態和生態關系非常重要，可以為研究物種起源、品種分類、親本選配、品種保護等提供依據，是支持新品種開發和研究，保護和利用現有種質資源的重要基礎[3-5]。

隨著基因組學的發展，基于特定基因家族或基因潛在可變區域來評估遺傳變異的技術已得到廣泛應用，此方面的研究已在多種植物中報道過，其中內含子長度多態性（intron length polymorphism，簡稱ILP）是研究特定基因家族內含子的有效工具[6-7]。內含子為非編碼序列，更容易積累變異，且內含子的位置在物種間存在高度保守性[8]。微管蛋白基因家族對維持細胞的形態和功能及植物的正常生長發育具有重要調節作用，而且廣泛參與調節植物的生物和非生物脅迫[9-11]。有研究發現，植株的矮化與植物體中微管的減少、變短和分離相關[12]。侯董亮等研究表明，轉錄本號為PCP044487.1的β微管蛋白基因可能與梨矮生性狀形成的分子調控有關[13]。張海月等的研究結果表明，來自蘋果的β微管蛋白基因家族成員之一（轉錄本號為MDP0000749824.1）的表達水平，可能受激素調控的作用進而對莖的伸長生長造成影響等[14]。因此，對β微管蛋白基因家族進行研究具有重要意義。

基于微管蛋白多態性（tubulin-based polymorphism，簡稱TBP）分子標記技術是通對植物β微管蛋白家族基因DNA內含子的長度來評估遺傳變異，對于植物物種遺傳多樣性分析和植物分類學來說是非常有效的[15-18]。通過設計在兩側外顯子上的引物來檢測內含子的長度，比引物設計在非編碼區域的分子標記，更能直接反映基因內的變異，且不受表型影響，操作簡單方便、試驗結果穩定，對廣泛生物的遺傳識別非常有用，具有更廣闊的應用前景[19-21]。經過近幾年的迅速發展，TBP分子標記已應用于多種植物的多個研究領域，在植物種質資源遺傳多樣性與親緣關系分析等方面均取得了階段性的進展，但未見相關中文報道。本研究對TBP標記技術原理及在植物遺傳多樣性研究中的應用進行綜述，以期為該標記的研究和應用提供參考。

1 TBP分子標記技術

1.1 TBP分子標記技術原理

β微管蛋白是微管的主要組成成分之一，與α微管蛋白共同參與細胞形態的維持、胞內物質運輸、細胞分裂、細胞運動等活動[22-25]。研究發現，動物、植物、原生生物和真菌中的β微管蛋白氨基酸序列相似性高達88%以上[26-28]。目前為止，很多植物的β微管蛋白基因已被克隆或鑒定，例如在擬南芥中有9個β微管蛋白基因[29]、水稻中有8個[30]、玉米（Zea mays L.）中有6個[31]、毛果楊（Populus trichocarpa Torr. & Gray）中有20個[32]、美洲山楊（Populus tremuloides Michx.）中有20個[32]、旱柳（Salix matsudana Koidz.）和龍爪柳[S.matsudana var. tortusoa （Vilm.） Rehd.]中均有20個[26，33]，此外，亞麻（Linum usitatissimum L.）[34]、梨（Pyrus spp.）[28]、蘋果（Malus Mill.）[14]中已有關于β微管蛋白基因的報道。植物β微管蛋白基因的組成通常是保守的，有2個內含子位于編碼區中的固定位置，且2個內含子大小不一致[35]。所有植物β微管蛋白基因組第1個內含子位于ATG密碼子的396個核苷酸位置，第2個位于742個核苷酸位置，其中玉米β微管蛋白基因（TUB1）和水稻β微管蛋白基因（TUB2）是例外，它們只有第1個內含子[18]，不同的β微管蛋白基因的內含子的長度是不同的。TBP分子標記的原理如圖1所示。

1.2 TBP分子標記的特點

傳統的隨機DNA分子標記已被證明是有效且可靠的，但這些標記也存在一定的缺點和不足。例如，擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP）標記試驗成本高、技術繁瑣、耗時較長，對樣本DNA的純度和內切酶的質量要求較為嚴格[36];隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）技術穩定性和重復性不好，試驗結果不夠可靠[37];簡單重復序列標記（simple sequence repeats，簡稱SSR）技術引物開發成本高，且只能對重復序列區域進行染色體定位等[38]。

與目前大多數分子標記的方法相比，TBP分子標記技術有如下特點[18，39]：（1）不需要有關植物基因組的序列信息;（2）基于β微管蛋白基因DNA序列，提供了一個幾乎是單個位點的靶點，而其他植物基因家族的成員往往在基因組中排列緊密;（3）不受進化環境等條件約束;（4）引物具有通用性?；趦群臃蔷幋a區，設計引物簡單，可以使用1對通用引物來完成;（5）建立在以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，簡稱PCR）基礎之上，擴增產物可用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測，試驗過程操作簡單;（6）對DNA的質量要求低、用量少、靈敏度高;（7）多態性豐富;（8）數據分析簡便。

1.3 TBP分子標記的引物設計

植物β微管蛋白基因的第1個內含子的位置是非常保守的，位于所有植物物種ATG密碼子的396個核苷酸位置。根據第1個內含子序列的位置來設計TBP-F和TBP-R引物擴增目的基因片段。目前已篩選并應用于試驗研究的引物總結如表1所示。

1.4 PCR反應體系

TBP是PCR為基礎，其中PCR的反應體系和反應條件是影響試驗結果的重要因素[42]。Bardini等通過試驗，建立了以20 μL反應體系為基礎的PCR檢測方法，發現最適條件：94 ℃預變性 3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個循環;最后在72 ℃延伸8 min，并保持在15 ℃，該反應體系和條件已成功應用于油菜（Brassica napus L.）、咖啡（Coffea Linn.）、亞麻等植物品種[18，39]。Gavazzi等對葡萄屬（Vitis）的植物進行TBP分析，得出最佳PCR條件為：94 ℃預變性4 min;94 ℃ 45 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個循環;最終在72 ℃延伸30 min[40]。

1.5 PCR 產物檢測

分子標記的檢測主要利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳2種技術[43]。Bardini等的研究結果表明，6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測TBP分子標記效果最好[18，39]。隨著科學技術的發展，Gavazzi等研究出基于毛細管電泳和熒光檢測TBP的技術，與傳統方法相比，該方法具有試驗操作可自動化、速度快、分辨率高、重現性好等特點[41]。

2 TBP分子標記技術的應用

2.1 遺傳多樣性分析

微衛星簡單序列重復（sinple sequence repeat，簡稱SSR）因多態性高、數量豐富、重復性好、呈共顯性，且廣泛分布于基因組等優點，已廣泛應用于植物遺傳多樣性的研究中[44]。

Bardini等利用TBP分子標記方法研究了6個品種油菜的遺傳多樣性，并與SSR方法進行比較分析[18]。凝膠電泳結果表明，2種方法均顯示了品種間和品種內的多態性。通過對6個品種進行266個指紋分析，主成分分析結果表明，TBP方法提供了關于遺傳相似性的信息，類似于使用SSR標記獲得的結果。利用分子方差分析法（analysis of molecular variance，簡稱AMOVA）分析數據，驗證2種方法在油菜品種間和品種內的區別程度。TBP方法能夠檢測出品種間的方差為66%，品種內的方差為34%，這些值與SSR分子標記中80%和20%的值相差不大。此外，利用遺傳估算值比較分析2種方法在品種鑒定能力的相似性，得到的相關值為0.65（P>0001）。Rabokon等利用TBP和SSR分子標記比較分析亞麻屬植物的遺傳變異與16個亞麻品種TBP的結果表明，樣品中均檢測到大量單一性條帶，多態信息含量（polymorphism information content，簡稱PIC）為0.48，Nei和Li的相似系數在大多數基因型中都在0.25～1.00范圍內。SSR分析結果表明，在16個樣本中Nei和Li的相似系數值均在0.0～1.0之間，PIC分別在0.81～0.61之間[39]。以上研究結果證明，TBP可以成功地應用于亞麻品種和基因型的鑒別，并且操作時間相對較少，不須要處理大量的數據。根據計算出的PIC，TBP數據同SSR分析中得到的數據一樣可靠，TBP方法對亞麻基因型的分辨具有較高的效率。Gavazzi等對來自葡萄屬37個材料進行TBP分子標記分析，并與6組SSR標記結果進行比較，結果表明TBP方法在葡萄屬基因分型領域具有可行性和可靠性[40]。

以上研究結果均表明，TBP分子標記與SSR分子標記的分析結果基本一致，進一步證明TBP分子標記的可靠性，且TBP分子標記更能揭示供試材料的親緣關系，具有高效性，可以單獨使用，也可以和其他標記方法同時使用，有利于減小單一標記方法使用時的誤差。

2.2 種質資源親緣關系分析

近年來，由于各地域相互引種，種質交流日益頻繁，不斷出現同物異名或同名異物的現象，這使得對種質的鑒定提出了更高的要求。同時，通過傳統鑒定方法進行品種的鑒別和雜種鑒定，其周期較長，而且表型性狀等形態學特征容易受到環境條件的影響[45-46]，因此TBP分子標記的應用為植物種質鑒定研究提供了一種新方法，為豐富種質資源的遺傳多樣性研究提供一條新途徑。

Bardini 等利用TBP分子標記對來自于不同國家的二倍體咖啡C. eugenoides 、C. canephora以及四倍體咖啡C. arabica進行分析，在四倍體咖啡C. arabica樣本中均擴增出4個TBP條帶，在C.canephora樣本中擴增出其中3條，沒擴增出的那條在C. eugenoides樣本中擴增出來，支持C. eugenoides是C. arabica的祖源的假設[18]，這與Anthony等通過擴增片段長度多態性（amplified fragment length play morphism，簡稱AFLP）和SSR標記所獲得的研究結果[47]一致。此外，有研究者對5種百脈根（Lotus alpinus、 L. corniculatus、 L. angustissimus、L. tenuis、L. pedunculatus）進行TBP分析，其中四倍體L. corniculatus樣本具有較好的多態性。在L. corniculatus樣本中發現，與四倍體L. alpinus以及二倍體L. tenuis和L. angustissimus樣本中相似的條帶，而在二倍體和四倍體的 L. pedunculatus 樣本中未發現，證明L. pedunculatus 不是L. corniculatus的祖先，這與Campos等的研究結果[48]一致。L. alpinus和L. tenuis的祖先可能是L. corniculatus，這與Roos等的研究結果[49]一致。此外，二倍體和四倍體的L. pedunculatus TBP條帶沒有差異，證明該四倍體是同源多倍體。相比較于表現出單一獨特模式的二倍體L. alpinus TBP結果，四倍體L. alpinus則具有更顯著的變化特征，表明四倍體L. alpinus并非源自二倍體L. alpinus的同源四倍體，更有可能來自2個二倍體物種之間的雜交。

此外，TBP分子標記在大麥、水稻和小麥研究中也有應用，但多態性低。目前，通過引物序列的修改已在菊花屬和木筒篙屬中成功地擴增出TBP條帶[18]。

3 問題與展望

TBP作為一種新型的分子標記，已成功地應用于大范圍的單子葉和雙子葉物種，并同SSR標記獲得的數據進行比較分析，充分證明了TBP的可靠性。此外，TBP不需要植物基因組更多的信息，試驗操作簡單、快速、經濟，該方法適合于評估遺傳多樣性和基因組起源。然而，與目前其他DNA分子標記的方法相比，TBP分子標記具有一定的局限性：（1） TBP方法只能檢測1組有限的標記，與SSR或其他方法相比，需要大量試驗材料來獲得統計學上有意義的系統發育樹。（2） 對于高自交系栽培作物所獲得的遺傳多樣性水平低，原因可能是這些農業作物的近親繁殖[18]。

筆者認為，TBP分子標記的利用應加強以下幾個方面的研究：（1） 大量開發具有材料特異性的TBP引物。TBP分子標記引物的通用性強，但文獻報道的數量依然有限，無法滿足研究的需要。（2） 建立并優化適合TBP分子標記類型的PCR反應體系。因為在標記分析同一材料時，PCR最優反應體系存在差異，而同一標記類型應用于不同的材料時，其體系也存在不同[50]。因此，建立優化適合特定材料的PCR反應體系和反應條件，是應用TBP分子標記的基礎。（3） 加強TBP分子標記在種質鑒定與指紋圖譜構建的應用。TBP作為一種新型分子標記在油菜、咖啡、亞麻、葡萄等植物中表現出優勢，成功應用于品種的鑒別和雜種鑒定，不僅可以實現品種保護，而且還可以提高種質純度，給生產與研究帶來了便利。雖然TBP分子標記技術在植物研究中的應用尚在起步階段，但相信隨著基因組學和檢測技術的發展，其在遺傳多樣性精確評價、種質資源的評價與利用、種質鑒定與輔助育種等方面具有廣闊的應用前景。

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