奧奈達希瓦氏菌吸收廢水中鐵離子的作用機制研究

（紹興市柯橋區環境保護監測站，浙江 紹興 312030）

1 引言

鐵載體是微生物和部分植物分泌到胞外進行結合并獲取鐵的小分子，其能與高親和力鐵結合。依據其與鐵結合的基團的化學性質，鐵載體主要分為氧肟酸鹽類、兒茶酚類以及羧酸鹽類三類。

隨著新的鐵載體結構被不斷解析出來，人們發現有些鐵載體包含兩種以上螯合鐵的基團，屬于“混合型”的鐵載體。氧肟酸鹽類鐵載體是自然界中最常見的，氧肟酸基團中的兩個氧原子與鐵原子形成二齒配體，因此每個此類鐵載體都能與Fe3+形成八面體的六齒配體。氧肟酸鹽類鐵載體與Fe3+的結合常數在1 022～1 032M-1之間，這種強結合能力保證其與鐵的復合物不會輕易被水解。奧奈達希瓦氏菌屬于革蘭氏陰性γ-變形菌門，其可在海水、淡水或一些沉積物中發現，是一種兼性厭氧菌，擁有超過40 多種細胞色素c，這使得其本身的顏色呈現特征性粉紅色，并且使其能夠呼吸多種電子受體，包括氧氣、甘氨酸、硝酸鹽、亞硝酸、鹽、硫、延胡索酸鹽、二甲基亞砜。這些特征使奧奈達希瓦氏菌在生物環境修復和燃料電池等方向備受青睞，是一種重要的環境模式生物。

本文主要研究了ΔputA 在液體LB 中的菌體，顏色為白色，并且其對鐵螯合劑2，2′-聯吡啶比MR-1 更為敏感，這說明PutA 是鐵吸收的一個關鍵蛋白。而通過測量胞內heme 發現，ΔputA-WC 菌株中heme 含量比MR-1 中低，即ΔputA 的白色表型是由其胞內heme 缺乏引起的。

2 實驗材料和方法

所用試劑除非特別說明外，均購于sigma（shanghai，China）公司。基因水平方面的操作，E.coli 和S.oneidensis在有氧條件下培養時，采用Lysogeny Broth（LB，Difco，MI，USA）液體培養基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L），或者添加了1.5%（W/V）瓊脂的LB 固體培養基。液體LB 如無特殊說明均為過濾滅菌，經孔徑為0.22 μm的濾膜過濾。培養溫度分別為37 ℃和30 ℃。根據實驗需求，培養基中添加的化學物質和濃度為2，6-二氨基庚二酸（DAP）0.3 mM，氨芐青霉素50 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，慶大霉素50 μg/mL。

3 實驗步驟

3.1 heme stain 染色

heme stain 用于細菌胞內細胞色素c 的染色，具體流程：取2 mL OD600=1.0 的菌液，用PBS 緩沖液沖洗2 遍，隨后以12 000 r/min 轉速離心1 min。接著用500 μL PBS 溶液重懸后，取40 μL 樣品進行SDS-PAGE 電泳實驗。此電泳要在4 ℃下進行，并且需要遮光。電泳結束后，使用TMBZ 染液進行染色1.5 h（染色過程也要避光）后，加雙氧水（終濃度30 mM）進行顯色。TMBZ 染液由兩部分溶液混合而成，0.2%TMBZ 溶液（溶劑是甲醇）和0.25 mol/L 乙酸鈉。兩種溶液在染色前混合即可，不可提前太久。

3.2 胞內heme 含量的測定

測量S.oneidensis 胞內heme 含量時，采用文獻[3]的方法進行。此方法原理是，heme 含有鐵元素，當加入大量還原劑后，其中的鐵會還原成二價鐵，還原態heme 與吡啶可以形成吸光系數很高的復合物，通過測定特定波長的吸光度可以檢測heme 的含量。此方法共使用了三種溶液，溶液I包含40%（V/V）吡啶、0.2 M NaOH 和500 μM 鐵氰化鉀K3[Fe（CN）6]。吡啶用來結合還原態heme，NaOH 可以給連二亞硫酸鈉提供堿性環境，鐵氰化鉀能先將所有heme 變成氧化態。溶液II 是0.1 M 鐵氰化鉀，而溶液III 是0.5 M連二亞硫酸鈉（溶劑：0.5 M NaOH）。樣品中heme 的含量可通過還原態heme 與吡啶的復合物的吸光度來確定。

3.3 胞內總鐵含量測定

本研究測量胞內總鐵采用的是菲洛嗪（Ferrozine）顯色法。菲洛嗪能與二價鐵離子結合成一種復合物，該復合物在550 nm 波長處有吸收峰。由于菲洛嗪不與三價鐵離子結合，所以需要用抗壞血酸將樣品中所有鐵還原成二價。鐵被吸收至細菌胞內后，會被儲鐵蛋白結合成復合物，在測量之前，需要用鐵釋放劑（iron-releasing regent）將鐵游離出來。鐵釋放劑配方：新鮮配制的1.4 M 鹽酸和4.5%（W/V）KMnO4等體積混合。之后再用鐵檢測試劑（iron-detection reagent）進行測量。鐵檢測試劑配方：6.5 mM 菲洛嗪、6.5 mM 新亞銅試劑（neocuproine）、2.5 M 醋酸銨、1 M 抗壞血酸。菌樣離心收集后，用預冷的PBS 洗2 遍，再用50 mM NaOH 懸浮后超聲破碎。100 μL 細胞裂解液與100 μL 10 mM 鹽酸混合后，加入100 μL 鐵釋放劑，60 ℃恒溫置于通風櫥中2 h。冷卻至室溫后，加入30 μL 鐵檢測試劑，30 min 后取出280 μL加入96 孔板中，測量其在550 nm 波長下的吸光度。

4 實驗結果分析

由于PutA 與S.oneidensis 鐵載體吸收的密切關系，猜想ΔputA 在缺鐵的環境中不能有效轉運鐵，因此其生長會受到影響。所以在LB 中添加不同濃度的鐵螯合劑2，2′-聯吡啶來觀察ΔputA 的生長情況。結果如圖1 所示，在LB 中不存在聯吡啶情況下，ΔputA 的生長和MR-1 相差很小。這是由于LB 中鐵元素和其他營養成分含量豐富，細菌不需要分泌鐵載體就已經能夠獲得維持自身生長所需鐵原子。而在LB 中添加50 μM 的2，2′-聯吡啶，ΔputA 就已經表現出了明顯的生長缺陷，而此時野生型生長基本不受影響。當LB中的2，2′-聯吡啶達到150 μM 時，ΔputA 已完全不能生長。此實驗說明，在缺鐵環境中，PutA 的功能對S.oneidensis 的生長是十分重要的。

圖1 實驗結果

當S.oneidensis 處于鐵匱乏的環境中時，其對鐵的需求主要依靠分泌鐵載體進行螯合鐵，再將鐵-鐵載體吸收至胞內消化。PutA 作為S.oneidensis 分泌的鐵載體、putrebactin的受體，當LB 中添加鐵螯合劑2，2′-聯吡啶使之缺鐵時，ΔputA 不能將胞外的鐵-鐵載體轉運至胞內，使其生長出現缺陷。

5 結語

PutA 作為S.oneidensis 合成的鐵載體、putrebactin 的受體，其敲除突變株在LB 中呈現白色性狀。在LB 中添加2，2′-聯吡啶使其鐵處于缺乏狀態時，ΔputA 相比于野生型表現出了明顯的生長缺陷。這是由于S.oneidensis 吸收環境中的三價鐵主要靠分泌出的鐵載體，后者螯合鐵被PutA 吸收進胞內。putA 基因的破壞會導致S.oneidensis 吸收鐵的途徑受到破壞，從而使ΔputA 在LB 中生長時難以獲取足量的鐵而呈現白色菌體表型。因此，奧奈達希瓦氏菌在生物環境修復中應用前景非常廣泛。