基于蛋白組學對苯胺降解菌Rhodococcus sp.AN-P1苯胺脅迫響應的研究

劉冰霜，王 臣, ，楊 沖, ，劉慶華，譚周亮

（1.中國科學院成都生物研究所/中國科學院環境與應用微生物重點實驗室，四川 成都 610041；2.中國科學院大學，北京 100049）

【研究意義】苯胺（aniline）作為芳香族化合物的一種，是300多種化學物質的重要中間產物，廣泛應用于染料、農藥、塑料、橡膠添加劑、炸藥等行業［1］。苯胺自身穩定性高、生物毒性大、難降解并具有“三致”作用，其在環境中的殘留將會對動、植物造成嚴重危害，被列入我國“十四類環境優先污染物黑名單”及美國EPA“環境優先控制污染物黑名單”（EPA; www.epa.gov）。因此，針對環境中苯胺的有效處理、減少其對環境的污染是污染防治領域中面臨的重要課題。由微生物介導的生物修復在此過程中展現出有效修復污染環境的巨大潛力，但因缺乏有關污染環境對微生物生長和代謝影響的信息，從而限制了微生物在環境修復中的應用［35］。而通過對苯胺脅迫下苯胺降解微生物響應機制的研究，將會豐富這一信息，并為進一步調控提高微生物降解苯胺能力提供良好的靶點、為其生物修復研究奠定基礎。【前人研究進展】目前苯胺的處理方法很多，因生物法處理苯胺具有成本低、經濟效益高、環境友好性等優點，近年來越來越多的苯胺降解菌被分離出來，如Klebsiellasp.ZL-1［2］、Pseudomonassp.Z1［3］、Rhodococcussp.Strain ATCC 49988［4］等，同時苯胺生物降解機理也得到了詳細綜述［5-6］。有研究指出，通過微生物脅迫響應機制對環境微生物準確調控將是一個強化微生物降解能力、提高修復效率的有效和通用解決途徑［7］。如 Wang等［8］研究了Rhodococcusruber TH3在熱激條件下的適應機制，并通過過表達顯著響應蛋白Hsp16成功提高了菌株在熱激、50%丙烯酰胺脅迫下的存活率。但在環境微生物苯胺脅迫響應機制方面僅在RubrivivaxbenzoatilyticusJA2［9］菌株中被闡述，而作為生物修復最佳菌株之一的Rhodococcussp.苯胺響應機制還不清楚。【本研究切入點】JA2菌株雖然對苯胺具有一定的耐受性，但其本身不具有苯胺的降解功能，也就是說目前對苯胺降解菌在適應苯胺脅迫方面的研究還未見有報道。Rhodococcussp.AN-P1作為一株苯胺高效降解菌，可以降解和耐受30 ～ 40 mmol/L的苯胺，在2 000 mg/L苯胺條件下，可在32 h內就能使出水達到《污水綜合排放標準》一級標準［10］，且基于AN-P1的生物強化序批式反應器系統穩定運行后對苯胺及化學需氧量的去除率可分別超過96.3%和81.3%［11］。研究其在苯胺脅迫下的響應機制，不僅可以解釋菌株AN-P1優良的苯胺降解和耐受能力的原因，還可以豐富微生物對環境污染物響應機制。【擬解決的關鍵問題】本研究采用雙向電泳及質譜技術，分析AN-P1在苯胺脅迫下的蛋白質表達響應情況，揭示AN-P1苯胺降解途徑，闡述苯胺降解菌在苯胺脅迫下的適應、降解機制，彌補苯胺降解菌對耐受、降解苯胺這一機制的空缺，并為提高環境微生物處理苯胺的能力奠定理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及菌株培養

菌株AN-P1為實驗室保藏菌株，根據16S rDNA基因序列分析顯示該菌株屬于Rhodococcussp.（GenBank 登錄號：FJ827255）［10］。將 AN-P1菌株活化后，分別接種于以1 500 mg/L苯胺和10 g/L檸檬酸鈉為唯一碳源的無機鹽培養基中，在30℃、200 r/min的恒溫振蕩器中培養。無機鹽培養基組分：Na2HPO42 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、微量元素溶液5 mL/L，pH7.0，121℃滅菌 20 min。

1.2 蛋白質樣品的制備

按上述培養方法將菌懸液培養至OD600達到0.8～1.0之間。10 000 g，4 ℃條件下離心15 min棄上清液，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體3次，再用雙蒸水洗滌菌體2次后，收集菌體。收集的菌體采用超聲破碎法提取蛋白質：取一定量菌體，用1 mL裂解液（8 mol/L尿素，4% CHAPS，2 % IPG緩沖液，40 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，1 μL（500 U）核酸酶充分懸浮菌體；再用杯式超生細胞粉碎機（Scientz08-I，寧波新芝）進行超聲處理直至菌懸液清澈，最后20 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清，-20 ℃保存備用。

1.3 雙向電泳及圖譜分析

用Bradford比色法［12］測定蛋白濃度，取2 mg蛋白質樣品并將其固定在pH 4～7 IPG非線性梯度條（Bio-Rad, USA）上。第一維等電點聚焦（30 V，6 h；500 V，2 h；10 000 V，3 h；110 000 Vh）、膠平衡、第二維SDS-PAGE垂直電泳程序以及凝膠染色等步驟參照劉冰霜等實驗過程［13］。顯色后的凝膠用ImageScanner Ⅲ多功能激光掃描成像儀掃描獲取圖譜，再用凝膠分析軟件ImageMaster 2D Platinum 6.0 進行雙向電泳的圖像分析。

1.4 蛋白質表達差異點鑒定

在圖譜上標記差異的蛋白質點，并從膠上切取下來裝入EP管中，加雙蒸水保存。切取蛋白質點委托北京華大蛋白質研發中心有限公司進行基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS，UltrafleXtrem，Bruke）鑒定，并根據各肽段M/Z數據，利用Mascot（http://www.matrixscience.com）軟件，在NCBInr蛋白數據庫中搜索理論上能與酶解肽段相匹配的蛋白。

2 結果與分析

2.1 雙向電泳圖譜檢測

蛋白質組學是分析細胞內所有蛋白質的高通量方法。而蛋白質又是細胞生命活動中的重要功能生物分子，因此通過分析生物體內蛋白質水平變化對于檢測微生物在生物降解過程中的生理狀態非常重要［14］。本研究以檸檬酸鈉為唯一碳源培養的AN-P1蛋白組電泳圖中共檢測到579個蛋白質點（圖1A）；而以苯胺唯一碳源培養的AN-P1蛋白組電泳圖中共檢測到681個蛋白質點（圖1B）。對這些蛋白質點進一步分析和鑒定將有助于闡述苯胺降解菌對苯胺脅迫的適應機制。

圖1 Rhodococcus sp.AN-P1在不同條件下蛋白質組雙向電泳圖Fig.1 Two-dimensional electrophoresis diagram of the proteome of Rhodococcus sp.AN-P1 under different conditions

2.2 差異表達蛋白的鑒定

如圖1B中黑色方框所示，從以苯胺為唯一碳源的電泳圖譜中選取21個與檸檬酸鈉為唯一碳源電泳圖譜顯著差異的蛋白質點，利用質譜進行分析，獲得這些蛋白質點的肽質譜指紋圖譜。根據得到的肽質譜指紋圖譜及其分子量范圍等數據，通過Mateix science網站提供的MASCOT軟件查詢與之相匹配的蛋白，如果蛋白質點的Mascot得分大于82（P＜0.05）則認為該蛋白點被成功鑒定，并從給出的候選蛋白中選擇與AN-P1最接近物種的蛋白質作為鑒定結果，否則視為未得到鑒定。如表1所示，蛋白質點Mascot得分大于82的共有17個，即成功鑒定17個蛋白質點，有4個蛋白質點未鑒定成功（未展示）。其中，成功鑒定的蛋白質點按功能可分為信號傳導系統蛋白、氨基酸及能量代謝系統蛋白、細胞防御系統蛋白、苯胺降解酶等。另外，從蛋白質相對分子質量、等電點來看，大部分成功鑒定的蛋白質相對分子質量在31 000 ～ 58 000之間，等電點位于4～7之間，證明本研究中選擇的IPG非線性梯度條非常適合該條件下物種蛋白質的二維電泳分離。從蛋白質匹配上的物種來看，17個蛋白質點均來自于非Rhodococcussp.物種，這可能是由于AN-P1菌株屬于Rhodococcussp.新種或者是Rhodococcussp.蛋白組信息不全面所導致。

表1 苯胺誘導條件下的AN-P1蛋白斑點的鑒定Table 1 Identification of protein spots of AN-P1 induced under aniline conditions

3 討論

3.1 信號傳導調節系統

雖然苯胺可以作為碳源、氮源及能源被微生物所利用，但同時作為有機溶劑也會對AN-P1產生毒害影響。當AN-P1暴露在苯胺環境中時，首先會通過信號傳導系統感知外界環境的變化，如組氨酸激酶（#3418）。組氨酸激酶是一個雙組分信號傳導系統，其在感知脅迫存在及調節菌株適應環境方面發揮重要作用［15］。如Erythrobacter litoralisDSM8509在響應光照脅迫時可通過組氨酸激酶感知光照的改變進而調控其他基因表達［16］。而為了適應新環境，新蛋白質的合成又是必不可少的，這一點也從檢測到與基因轉錄和翻譯相關蛋白的表達得到了驗證，如Fis族轉錄調節因子（#3095）、延伸因子Ts（#3584）的表達。

3.2 氨基酸及能量代謝

除上述參與調控轉錄和翻譯相關蛋白外，參與氨基酸合成的酶類在細胞適應苯胺脅迫環境中也發揮著至關重要的作用。如吲哚-3-磷酸甘油合成酶（#3559），一種色氨酸生物合成酶，其參與合成的色氨酸在多種脅迫條件下發揮作用［17-18］，可協助參與細胞壁的合成及脂質代謝［19］。同時其他氨基酸代謝相關的蛋白也被檢測到，包括3-羥基異丁酸脫氫酶（#3496）（參與纈氨酸代謝）羥甲基戊二酰COA裂解酶（#3526）（參與亮氨酸代謝）、氨基轉移蛋白（#3422）等。這些變化可維持胞內氨基酸平衡，滿足脅迫條件下蛋白質合成增加的需求。另外，微生物在脅迫條件下為了抵抗脅迫環境往往對能量的需求也會增加［20］，研究表明AN-P1在苯胺脅迫條件下ATP合酶F1（#3398）上調表達，有助于生產更多的能量用于抵抗苯胺脅迫環境。

3.3 細胞防御系統

通過進一步分析發現，AN-P1還可以調節GroEL（#3827）、DnaK（#3899）、UspA域蛋白（#3068）等細胞防御相關蛋白的表達，以適應苯胺脅迫。研究表明，熱激蛋白（Heat shock protein，Hsp）GroEL和DnaK可在多種脅迫條件下響應表達，如有機溶劑/有毒化學物質脅迫［21］、高溫脅迫［22］以及其他氧化應激脅迫［23］。熱激蛋白除了在防止蛋白質變性、降解和聚集等方面發揮重要作用外，還可以提高細胞對脅迫的耐受力、維持細胞正常的代謝功能、提高細胞活力、減少環境脅迫造成的傷害［24］。通用應激蛋白（Universal stress protein, Usp）則可以提高長期暴露于脅迫條件下細胞的存活率，保護細胞免受有毒化學物質、滲透脅迫以及紫外線脅迫等的傷害［25］。因此，這些蛋白在AN-P1中的表達可能有助于提高細胞對苯胺脅迫的抵抗能力，從而達到適應苯胺環境的需求。

3.4 苯胺降解酶系統

在不同底物條件下，微生物有著不同的代謝途徑，如Rhodococcus jostiiRHA1是利用β-酮己二酸代謝途徑代謝原兒茶酸、利用羥基喹啉代謝途徑代謝4-羥基水楊酸等［26］。在本研究中也檢測到一些與苯胺代謝相關的酶類，如環羥基化雙加氧酶α亞基（#3598）、末端雙加氧酶大亞基（#3593）以及鄰苯二酚2,3-雙加氧酶（#3544）。環羥基化是最常見的初始降解步驟之一，因此是環羥基化雙加氧酶也是芳香環起始降解的重要催化酶之一［27-28］。典型的環羥基化雙加氧酶由末端雙加氧酶和電子轉移酶組成，而末端加氧酶作為催化中心可以接收來自電子轉移組分的電子［29］。苯胺降解途徑表明，苯胺可在有氧條件下經過苯胺環羥基化雙加氧酶被轉化為鄰苯二酚，然后鄰苯二酚再在鄰苯二酚1,2-雙加氧酶的作用下降解為cis,cis-粘康酸（鄰位代謝途徑）或在鄰苯二酚2,3-雙加氧酶作用下降解為2-羥基粘康半醛（間位降解途徑）［30］。由于本研究中檢測到鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的表達，證明了AN-P1是以間位降解途徑來代謝苯胺的。AN-P1的這一苯胺代謝方式與Rhodococcus rhodochusstrain CTM［31］、Rhodococcussp.strain DK17［32］相同，但與Rhodococcus erythropolisAN-13［33］、Rhodococcussp.22［34］不同。

4 結論

苯胺作為重要的化工中間體，其在環境中的廣泛分布及對水生態的影響引起眾多學者的關注。就其生物降解途徑至今已得到詳細研究，但環境微生物對含苯胺環境的響應機制還鮮有研究。本文通過蛋白質組學技術，分析了苯胺降解菌Rhodococcussp.AN-P1在苯胺脅迫下的蛋白質表達情況。研究結果表明，苯胺降解菌AN-P1在苯胺脅迫環境中會通過響應信號傳導系統感知外界脅迫、調節氨基酸及能量代謝系統抵抗苯胺的毒害影響、利用細胞防御系統進一步提高其存活能力、表達苯胺降解酶系統降解苯胺獲得碳源、氮源及能量來源，從而形成AN-P1菌株在苯胺脅迫條件下的適應及生存機制。另外，通過對AN-P1苯胺脅迫下蛋白組學的分析也揭示了AN-P1菌株是通過間位降解途徑來降解苯胺的。本研究不僅補充了苯胺降解菌在苯胺脅迫條件適應機制的空白，本所鑒定的蛋白質點可為將來進一步調控提高微生物苯胺降解能力提供良好的靶點，為其生物修復研究奠定基礎。