乳酸桿菌對東北酸菜發酵特性的影響解析

李鳳姿， 張 媛， 王小壘， 吳 昊， 楊洪巖

（東北林業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱150040）

東北酸菜是以新鮮白菜為原料，主要依靠乳酸菌發酵獲得的地域性家常特色食物，具有香氣濃郁、味道鮮美、組織嫩脆、可增進食欲等特點。市場需求的不斷擴大推動著酸菜產業化進程的加快，但如今東北酸菜的多數加工企業由于技術缺乏、急于上市等原因仍采用傳統的自然發酵方式生產酸菜，并在成品酸菜中添加防腐劑[1]，嚴重影響著酸菜產品質量及安全性。在酸菜生產中應用人工接種發酵不僅可以控制發酵進程、縮短產品的成熟時間，而且能得到質量穩定的產品，減少防腐劑的使用[2]。應用乳酸菌對酸菜進行接種發酵是未來酸菜生產的必然趨勢。

根據發酵類型可以將乳酸菌分為兩類：異型發酵乳酸菌和同型發酵乳酸菌。異型發酵乳酸菌在發酵過程中產生乳酸、乙酸、CO2等產物，而同型發酵乳酸菌在發酵過程中主要產生乳酸。接種的乳酸菌種類不同，發酵過程中微生物多樣性和生化特性也有所不同。選擇從原始產品中分離出的同時是優勢菌屬的乳酸菌作為接種劑可以更有效地降低發酵失敗的風險，得到與自然發酵風味更接近的產品[3-5]。東北酸菜自然發酵過程中占優勢的、不同發酵類型的菌株有短乳桿菌、彎曲乳桿菌、植物乳桿菌、寡發酵乳桿菌等[6-7]。在我們之前的研究中發現，向自然酸菜發酵體系中加入同型發酵乳桿菌和異型發酵乳球菌的作用效果不同，乳桿菌對于酸菜發酵起著主導作用[8]。但不同種的乳桿菌對于酸菜發酵進程的影響尚不明確，而這些數據的積累又是篩選高效穩定的酸菜發酵接種劑所必須的。

基于此，本研究篩選異型發酵乳桿菌短乳桿菌、寡發酵乳桿菌和同型發酵乳桿菌彎曲乳桿菌、植物乳桿菌，分別對傳統發酵酸菜進行接種，通過生理生化指標和微生物多樣性分析探索不同種類乳桿菌對酸菜發酵效果的影響，為篩選高效穩定的酸菜接種劑奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 原料與菌種

白菜：購自黑龍江省綏化市，實驗全程為同一品種；菌種：作者所在實驗室從自然發酵酸菜樣品中分離的短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、寡發酵乳桿菌（L.oligofermentans）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）和植物乳桿菌（L.plantarum）。

1.2 儀器與設備

微型pH計：日本Horiba公司產品；紫外分光光度計：北京普析通用儀器；Nanovue：美國GE公司產品；高效液 相色譜 （Highperformanceliquid chromatography，HPLC）：美國Waters公司產品；HPX-87H色譜柱：美國Bio-Rad公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 接種乳酸菌的篩選 從自然發酵的酸菜中分離的10株L.brevis、10株L.oligofermentans、5株L.curvatus、10株L.plantarum中各篩選一株生產迅速、酸積累量多的菌株。具體為：將從-70℃取出經二次活化的L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus、L.plantarum單菌落接種于液體MRS葡萄糖培養基中，L.brevis、L.curvatus、L.plantarum于37 ℃培養48 h，L.oligofermentans于25℃培養48 h。每隔8小時使用紫外分光光度計測OD600值；用微量pH計測定菌株培養液的pH值；取10 mL菌株培養液用蒸餾水稀釋10倍后，用0.1 mol/L標定后氫氧化鈉溶液滴定至pH值為8.3，測定其可滴定酸質量濃度（g/L）[9]。每個處理設3次重復。

1.3.2 發酵 采用傳統自然發酵方法[7]，每缸內裝約75 kg白菜，加入鹽（鹽與鮮菜質量比為1∶100）和水，用腌菜石壓實。實驗設置接L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus、L.plantarum和 不 接 菌（對照）的5個處理，菌株接種量為106個/g。酸菜發酵完成時間為30 d，每個處理設3次重復。取樣間隔設為發酵的第0、6、12、18、24、30天。

1.3.3 微生物計數及生化指標測定 菌落計數（CFUs）：采用平板梯度稀釋法；乳酸菌培養：采用MRS培養基，將稀釋的酸菜汁與50℃保溫的培養基混合均勻，30℃培養2 d后計數；一般細菌培養：采用營養瓊脂培養基，37℃培養2 d后計數。每個處理3次重復。

可溶性糖（WSC）采用蒽酮比色法測定。色譜分析有機酸條件為：5 mmol/L的硫酸作為流動相，總程序進行時間為15 min，流速為0.5 mL/min，柱溫30℃，進樣量為5 μL，紫外檢測器波長為205 nm。

1.3.4 DNA提取和高通量測序 提取緩沖液（Tris-HCl，pH 8.0）保存的菌體用細菌DNA提取試劑盒（Omega，USA）進行總DNA提取。 用Nanovue超微量紫外分光光度計對所獲取的DNA進行質量濃度測定，提取的DNA質量濃度應大于50 ng/μL，提取體積大于60 μL。將提取的12 d和30 d的酸菜中所含的菌體DNA委托北京市理化分析測試中心生物部進行高通量測序。對原始數據進行過濾處理，去除嵌合體序列得到有效序列后，在97%的相似水平下對所有序列進行OTU劃分，進而進行聚類分析，每一個聚類稱為一個物種操作單元 （Operational Taxonomic Units，OTU），對OTU的代表序列作分類學分析。基于分類學信息，在門和屬水平上進行群落結構的統計分析，綜合討論酸菜發酵不同接種處理的細菌群落。

1.3.5 數據分析與處理 應用Origin8.5軟件進行圖表繪制；采用SPSS 23.0軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 各乳桿菌菌株培養特性

本研究中液體MRS葡萄糖培養基的初始pH值為6.32，液體MRS木糖培養基的初始pH值為5.71，監測了48 h內每8小時的OD600、pH、可滴定酸的變化規律，結果見圖1。生長曲線結果顯示，在培養8 h后，L.curvatus生長曲線便趨于平緩；在16 h后，L.oligofermentans、L.plantarum生長曲線趨于平緩；L.brevis生長曲線一直在緩慢上升。在48 h結束時，L.plantarum的OD600值 最 高為2.44，L.brevis最 低 為1.59。在培養的前16小時內，菌株培養液的pH值快速下降。可滴定酸結果顯示，乳酸菌產酸能力與pH值有關，即隨著pH的下降，可滴定酸質量濃度在逐漸增加，說明產酸能力強的菌株也有較強的耐酸性 。L.brevis、L.oligofermentans、L.curvatus和L.plantarum的可滴定酸質量濃度在48 h時分別達到6.66、13.43、12.84、15.22 g/L。

圖1 菌株生長及產酸動態Fig.1 Dynamics of growth and acid production of four strains

2.2 酸菜發酵體系pH動態

發酵體系的pH動態變化見圖2。從圖2可以看出，接種乳酸菌的酸菜處理組pH下降速度比對照組快。接種乳酸菌的酸菜體系中pH的下降主要發生在前12天，對照組pH的下降主要發生在前18天。L.brevis接種的酸菜體系在第30天pH值是所有處理組中最高的。L.plantarum接種的酸菜體系pH下降最快，在第12天下降到3.5，之后其pH值也一直保持最低值。在發酵30 d結束時，所有酸菜的pH值都在4以下。

圖2 酸菜發酵體系pH和有機酸Fig.2 Dynamics of pH and organic acids （lactic acid，acetic acid）during sauerkraut fermentation

2.3 發酵過程中有機酸（乳酸和乙酸）的質量濃度

在以前的研究中發現，東北酸菜發酵體系的有機酸主要為乳酸和乙酸[7-8]。作者對這兩種有機酸進行了檢測，結果顯示所有接種處理的乳酸質量濃度隨發酵時間的延長在持續上升，僅對照組在發酵的第24～30天有輕微下降。 在發酵前6天，L.curvatus與L.plantarum接種處理的酸菜發酵體系乳酸質量濃度顯著比其他3組高 （p＜0.05）。發酵30 d時，L.curvatus接種處理的酸菜乳酸菌質量濃度最高，達到11.79 g/L，其次為L.plantarum，兩組差異不顯著。在發酵過程中，所有處理組的乙酸質量濃度也一直在上升，L.brevis、L.oligofermentans接種 處理組與對照組在發酵初期就有乙酸產生，而L.plantarum、L.curvatus接種的酸菜分別在發酵的第6天與第12天后才開始有乙酸產生。最終，L.brevis、L.oligofermentans接種處理的酸菜發酵體系乙酸質量濃度分別達到1.44 g/L和1.48 g/L，顯著高于其他3組。

2.4 發酵過程中的可溶性糖質量分數

發酵過程中的可溶性糖質量分數見圖3（a）。白菜初始可溶性糖的質量分數是38.83 mg/g，可溶性糖的質量分數在發酵過程中是一直下降的。在發酵的前18天，L.brevis、L.oligofermentans接種處理組可溶性糖質量分數下降的比較快，L.curvatus、L.plantarum接種處理組與對照組可溶性糖質量分數下降比較慢， 在第24天時，L.curvatus、L.plantarum接種處理組可溶性糖質量分數最高。到發酵完成時，所有處理組的可溶性糖質量分數都在5.6 mg/g以下。乳酸菌消耗發酵原料中的可溶性糖使體系中的pH迅速下降，并產生大量的有機酸[10]，可溶性糖的這種下降趨勢顯示了底物的消耗狀態，與體系的pH下降及有機酸尤其是乳酸的積累趨勢相符。

2.5 發酵過程中的微生物菌落動態

圖3（b）顯示了發酵過程中乳酸菌數量變化，在發酵過程的前6天，對照組的乳酸菌數量顯著少于接種乳酸菌的酸菜體系 （p＜0.05），L.curvatus與L.plantarum接種的處理組乳酸菌數量最高，分別是8.82 lg（CFU/mL）和8.7 lg（CFU/mL），這與其培養特性相一致。對照組乳酸菌數量到發酵第24天時一直緩慢增長，在第24天到達8.38 lg（CFU/mL）。接種處理組乳酸菌的數量一直在（8～9） lg（CFU/mL）。 圖3（c）顯示了發酵過程中其他細菌數量變化，在整個發酵過程中，所有處理組的其他細菌的數量在8 lg（CFU/mL）左右。

2.6 發酵過程中各接種處理的細菌群落多樣性

2.6.1 OTU分析 對樣品進行OTU聚類分析，涵蓋了2門、2綱、7目、16科、28屬。 不同處理組在12 d和30 d發酵時間點OTU數量見圖4。隨著發酵的進行，每個處理組OTU的數量都分別降低。即在發酵期間，白菜中的營養物質被不斷消耗，pH值在不斷降低，因為缺少營養物質和不耐酸，樣品中的微生物種類在不斷減少。

圖3 酸菜發酵體系中的可溶性糖質量分數和微生物數量動態Fig.3 Dynamics of water-soluble carbohydrates and colony forming units during sauerkraut fermentation

圖4 發酵第12天和第30天OTU數量Fig.4 OTU at 12 d and 30 d in the fermentation

2.6.2 不同處理的細菌菌群結構分析 高通量測序結果顯示，在門的水平上，所有處理組總細菌組成主要由厚壁菌門（Firmicutes）與變形菌門（Proteobacteria）組成，占據菌群總量的99.9%，見圖5（a）。在發酵整個過程中，Firmicutes始終占據主要優勢，相對豐度為60.2%～71.6%之間。其在所有接種處理中的相對豐度比對照組高，Proteobacteria的相對豐度較低。當發酵達到30 d，L.plantarum的厚壁菌門相對豐度最高。

圖5 不同細菌群落在門和屬水平上的組成Fig.5 Composition of the different bacterial communities atthe phylum and genuslevelsduring the fermentation

在屬的水平上，不同的酸菜樣品共分離得到31個屬，圖5（b）為相對豐度大于0.1%的菌群分布柱狀圖。在屬水平上主要檢測到的是乳酸菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、片球菌屬（Pediococcus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）。其它的菌屬主要包括Psudomonas、Acinetobacter、Serratia、Proteus、Klebsiella、Erwinia、Enterobacter、Citrobacter和Enterobacteriaceae等。 由圖5可知，所有處理中乳酸菌一直占據主要優勢。對于微生物整體組成，不同接種處理存在有明顯差異。所有接種處理組中Lactobacillus的相對豐度高于對照組。Leuconostoc的比例低于對照組，Enterobacteriaceae的比例高于對照組。12 d發酵時，各處理之間比較可見，L.curvatus接種處理中的Lactobacillus比例較高，Enterobacteriaceae和Psudomonas的比例較低；30 d發酵時，L.plantarum處理中Lactobacillus比例較高，Enterobacteriaceae和Psudomonas的比例較低。

3 討論

采用了4種乳酸桿菌作為接種劑，從發酵體系的理化指標和細菌群落的組成及動態變化對接種不同種乳酸桿菌對東北酸菜發酵特性的影響進行了系統的分析。

pH值是評定蔬菜發酵程度的重要指標[11-12]。pH值下降速度快，表明蔬菜進入定向發酵越早，酸菜成熟速度也就越快。本研究中，各接種處理組酸菜的pH值下降、乳酸產生速度均比對照組快，說明4種接種用乳酸桿菌均使發酵進程顯著縮短，這與已有關于蔬菜發酵文獻報道的結果類似[13]。本研究應用高效液相色譜法分析發酵體系中的乳酸和乙酸的質量濃度，結果顯示乳酸是酸菜中主要的有機酸，與已有的研究報道一致[14-15]。 在5組處理中，L.curvatus與L.plantarum接種處理的酸菜發酵體系乳酸質量濃度最高，說明同型發酵乳酸菌可以顯著提高發酵體系中的乳酸質量濃度[16]；L.brevis和L.oligofermentans接種處理的酸菜發酵體系乙酸質量濃度最高，且在發酵第6天，只在L.brevis、L.oligofermentans和對照組體系中檢測到乙酸，說明乙酸主要來源于異型發酵乳酸菌的作用[17]。乙酸被認為是有效的抗菌化合物，可以抑制發酵食品中病原真菌和腐敗菌的生長[18]，適當提高發酵酸菜中的乙酸質量濃度，對于產品風味的提高具有一定的積極作用[19]。

在發酵前6天，接種處理組乳酸菌數量高于對照組，是由于發酵開始時接入了數量較高的乳酸菌。在發酵第12天到發酵結束，各處理組乳酸菌數量區別并不顯著，與有關的接種蔬菜發酵文獻報道一致[20-21]。這說明接種處理在發酵前期對乳酸菌的數量有著顯著影響，之后隨著時間的延續影響不再顯著。可能的原因是當體系pH足夠低，有機酸積累到一定值時，體系內除乳酸菌外的其它菌不再生長，乳酸菌增殖也達到穩定的結果。本研究中L.curvatus、L.plantarum接種處理組酸菜的可溶性糖質量分數下降速度最慢，這與以往的研究結果不一致[8]，分析可能的原因是本研究中原料中的可溶性糖質量分數相對較高，乳酸菌發酵利用可溶性糖產生足夠的乳酸后使體系內的微生物消耗糖的速度減慢所導致。

作者用高通量測序技術分析了在第12天和第30天各處理組的細菌組成和動態變化。在門水平上，Firmicutes和Proteobacteria是酸菜樣品中的優勢細菌門，這與以往的研究結果一致[22-23]。酸菜發酵可分為兩個階段，即由Leuconostoc占優勢的異型發酵階段和以L.plantarum為主的同型發酵階段[24-25]。在本研究中，接種處理組Leuconostoc相對豐度低于對照組，Lactobacillus的相對豐度高于對照組。在本研究中，接種處理的酸菜體系Enterobacteriaceae和Psudomonas相對豐度低于對照組。已有的研究結果顯示，Enterobacteriaceae和Psudomonas會利用酸菜中游離的氨基酸生成破壞酸菜質量的生物胺（主要是腐胺和尸胺）[26]，同時與乳酸菌競爭使用糖類，減少乳酸的生成。乳酸菌會降低發酵體系的pH，生成有機酸、過氧化氫、細菌素等物質抑制Enterobacteriaceae、Psudomonas和Listeria monocytogenes等食源性病原菌和腐敗菌的生長[27-29]，這說明接種處理提高了酸菜的品質。接種處理使體系發酵前期的乳酸菌數量升高，乳酸菌可以利用少量的碳水化合物來合成大量的有機酸，進而造成體系pH的降低，抑制Enterobacteriaceae和Psudomonas的生長，這也與發酵蔬菜的研究結果一致[30-32]。

4 結 語

使用這4株乳酸菌接種酸菜縮短了酸菜的發酵時間，改善了酸菜的品質。結合生理生化指標及微生物組成分析結果，若欲使酸菜發酵體系的pH下降及乳酸積累更快，使用L.curvatus與L.plantarum更好，從終產品的微生物安全性來看，L.plantarum更值得推薦。本研究結果將為篩選符合不同發酵目的的接種劑提供技術參考。