Fgl2基因對H9C2心肌細胞凋亡的影響

仉慧穎 耿 威 陳 巖 趙 欣 邱一凡

(大慶油田總醫院心臟無創科，黑龍江 大慶 163001)

研究表明，各種心肌疾病中均出現心肌細胞凋亡，而心肌細胞凋亡是引起各種慢性心力衰竭、心室重塑等的主要因素〔1〕。因此，治療心肌疾病的關鍵措施是抑制心肌細胞的凋亡，改善心肌生存環境，減輕心臟重塑。纖維蛋白原樣蛋白(Fgl)2主要在T細胞、內皮細胞、巨噬細胞中表達，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，有免疫調節和凝血功能〔2〕。人Fgl2蛋白是纖維蛋白原家族的成員，與纖維樣蛋白有類似的結構，可直接催化凝血酶原轉化為凝血酶，將纖維蛋白原降解為不溶型纖維蛋白，最終形成血栓。目前以Fgl2為靶點的基因干預已成為治療缺血性心臟病、心力衰竭等新的有效靶點〔3，4〕。本研究中通過沉默H9C2心肌細胞中Fgl2的表達，探討其對細胞凋亡的影響其機制。

1 材料與方法

1.1細胞株 H9C2心肌細胞株購自中國科學院細胞庫。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司；陰性病毒和Fgl2 siRNA慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和電化學發光(ECL)試劑盒購自美國Piece；細胞凋亡試劑盒購自江蘇碧云天公司；酶切caspase3、Notch1、Hes1抗體均購自美國abcam公司；CO2細胞培養箱購自美國西盟公司；流式細胞儀購自美國Becton Dickinson公司；電泳凝膠圖像分析系統、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀均購自Bio-Rad公司。

1.3細胞培養 從-80℃冰箱取出裝有H9C2心肌細胞的凍存管，即刻放入37℃水浴鍋中解凍，期間輕輕搖動凍存管使其在1～2 min內溶解。將溶解后的細胞放在含有10%胎牛血清的RPMI1640細胞培養液中，37℃、5% CO2、95%飽和濕度的恒溫培養箱中培養。第2天換液。根據實驗需要傳代，取對數生長期的細胞用于實驗研究。

1.4細胞轉染及轉染效果檢測 以1×105個/孔將生長至對數期的H9C2心肌細胞接種于6孔細胞培養板中，細胞生長密度達到60%時更換為新鮮的培養基，空白試劑、陰性病毒和Fgl2 siRNA慢病毒感染H9C2心肌細胞，分別為空白對照組，陰性對照組及Fgl2-siRNA組。取感染后48 h的細胞，加入PMSF和RIPA裂解液置于冰上反應30 min，4℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白。取少量蛋白樣品BCA試劑盒對蛋白進行定量。取50 μg蛋白樣品于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電泳結束后PVDF轉膜、5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(1∶400稀釋的Fgl2和1∶1 000稀釋的GAPDH)，4℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，每次洗滌5 min，加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL化學發光劑顯色，室溫避光環境中顯影，定影。以GAPDH作為內參，分析Fgl2的蛋白表達水平。

1.5細胞凋亡檢測 以1×105個/孔的濃度將各組轉染后的細胞接種于96孔細胞培養板中，48 h后收集細胞，加入預冷的PBS洗滌細胞2次，250 μl的結合緩沖液重懸細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/ml。按照凋亡試劑盒說明書操作，加入Annexin V-PE/7-AAD進行雙標記，流式細胞術檢測細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

1.6Western印跡檢測酶切caspase3、Notch1、Hes1蛋白表達 取轉染后培養48 h的各組細胞，按照1.4方法提取細胞中的蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，檢測酶切caspase3、Notch1、Hes1蛋白表達。

1.7統計學方法 應用SPSS21.0軟件，計量資料組間差異比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1各組Fgl2蛋白表達水平比較 空白對照組和陰性對照組Fgl2蛋白表達〔(0.447±0.052) vs (0.442±0.056)〕差異無統計學意義(P>0.05)，Fgl2-siRNA組Fgl2蛋白表達(0.183±0.029)顯著低于空白對照組(P<0.01)。見圖1。

2.2各組H9C2細胞凋亡的比較 與空白對照組〔(1.26±0.28)%〕及陰性對照組〔(1.25±0.30)%〕比較，Fgl2-siRNA組H9C2細胞凋亡〔(5.77±0.58)%〕明顯降低(P<0.01)。

2.3各組酶切caspase3、Notch1、Hes1蛋白表達情況比較 與空白對照組及陰性對照組比較，Fgl2-siRNA組酶切caspase3蛋白顯著下調表達，Notch1、Hes1蛋白顯著上調表達(P<0.01)。見圖2，表1。

圖1 各組Fgl2蛋白表達

圖2 各組酶切caspase3、Notch1、Hes1蛋白表達

組別酶切caspase3Notch1Hes1空白對照組0.061±0.0121)0.365±0.0361)0.194±0.0291)陰性對照組0.062±0.0131)0.361±0.0391)0.196±0.0311)Fgl2-siRNA組0.032±0.0090.798±0.0540.669±0.057

與Fgl2-siRNA組比較：1)P<0.01

3 討 論

心血管疾病是嚴重危害人類健康的重要疾病，主要的發病機制是心肌缺血缺氧后引起的心肌細胞凋亡、心室擴張、心臟重塑，最終導致心力衰竭〔5〕。Fgl2是一種新的凝血因子，主要在內皮細胞、T細胞中表達。人Fgl2屬于纖維蛋白原家族，參與自然性流產、爆發性肝炎等的病理過程，通過觸發性炎癥/血栓的形成，高表達于局部組織，啟動凝血過程，導致微血栓形成、纖維蛋白沉積等，最終引起臟器的功能障礙〔6〕。研究顯示，沉默Fgl2基因的表達可降低糖尿病大鼠的心臟功能，抑制心肌細胞的凋亡〔7〕。

細胞凋亡是細胞的一種程序性死亡過程，對細胞功能維持、組織器官的形態發展有重要的生理意義〔8〕。本研究結果顯示，沉默Fgl2的表達后H9C2細胞的凋亡明顯降低。caspase家族是細胞凋亡過程中的重要通路，caspase3是caspase家族的關鍵酶，是細胞凋亡過程中的關鍵執行者，是多種凋亡刺激信號的最終匯集點，其活性是凋亡進入不可逆階段的標志，因此被稱為“凋亡的執行者”〔9〕。有研究顯示，下調caspase3的表達可降低心肌細胞的凋亡〔10〕。本研究結果說明沉默Fgl2表達可通過抑制酶切caspase3表達降低心肌細胞凋亡。

Notch信號通路是高度保守的信號轉導通路，調控細胞的增殖、凋亡、分化、器官發育等過程，其活化與炎癥、氧化應激等密切相關〔11〕。哺乳動物有4個Notch(Notch1～4)同源受體和5個同源配體。已有多項研究證實Notch1有抑制細胞凋亡的功能，Notch1信號通路的激活對心肌細胞的缺氧復氧有保護作用〔12〕。Hes1是Notch1信號通路最重要的靶基因，其表達是Notch1信號通路是否激活的重要標志。本研究沉默Fgl2表達后Notch1、Hes1蛋白表達均顯著上調。

綜上所述，沉默Fgl2表達可通過激活Notch1信號通路降低心肌細胞凋亡，為心血管疾病的分子靶向治療提供了一定的理論基礎。

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9韋家俊，李 浩，廖小明，等.肢體缺血后處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠 Caspase-3 和細胞凋亡的影響〔J〕.中國老年學雜志，2017；37(4)：804-6.

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11Turkoz M，Townsend RR，Kopan R.The Notch intracellular domain has an RBPj-independent role during mouse hair follicular development〔J〕.J Invest Dermatol，2016；136(6)：1106-15.

12Zhang C，Liu X，Zhang C，etal.Phosphorylated eEF2 is SUMOylated and induces cardiomyocyte apoptosis during myocardial ischemia reperfusion〔J〕.J Cardiol，2017；69(4)：689-98.