溫度、保濕時間及菌齡對擴展青霉H1侵染柑橘能力的影響

趙利娜， 李慧芳， 張曉云， 張紅印

（江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

柑橘在采后運輸貯藏期間的腐爛大多是由真菌侵染造成的[1-2]，黑腐?。˙lack rot）、褐腐?。˙rown rot）、炭疽病（Anthracnose）[3]等通常是采前已經(jīng)開始侵染柑橘，采后才發(fā)病。酸腐?。⊿our rot）[1]、青霉?。℅reen mold）、綠霉病（Blue mold）[4-5]等則是在采摘過程中及采后發(fā)生侵染。柑橘采后由擴展青霉（Penicillium expansum）[6]、意大利青霉（Penicillium italicum）、指狀青霉（Penicillium digitatum）等青霉屬引起的青霉病和綠霉病造成的腐爛最為嚴重[7]。柑橘的青霉病和綠霉病在柑橘果實上發(fā)病癥狀較為相似，侵入柑橘后傷口附近變軟，接著長出白色菌絲體，最后中間部位變?yōu)榍嗌蚓G色，腐爛范圍逐漸擴大，直至全果腐爛[8]。

病原菌成功侵染宿主不是一個簡單的過程。自然界中寄生能力較強的真菌可直接侵染宿主，或通過自然孔口進行侵染，如茄鏈格抱菌（Alternariasolani）可通過直接侵入的方式引起馬鈴薯的早疫病[9]。引起柑橘腐爛的P.digitatum、P.italicum等分布范圍較廣，但它們寄生能力較弱，多數(shù)情況下會潛伏在水果表面，不會對水果品質(zhì)造成影響，只有宿主表面出現(xiàn)傷口組織時才可以完成侵入[10]。因此，在柑橘采后運輸貯藏過程中要盡量避免果實出現(xiàn)傷口，以減少病原菌侵染的概率。當病原菌成功侵入到宿主體內(nèi)后，必須有適宜的溫度、濕度才能生長繁殖。P.italicum的發(fā)病溫度為23℃，P.digitatum發(fā)病溫度較P.italicum高，在儲藏初期柑橘的腐爛大都由P.italicum引起[11]。儲藏后期溫度逐漸升高，各種病原菌進入繁殖的活躍期，協(xié)同發(fā)揮作用。除此之外，病原菌的菌齡也會影響其侵染宿主的能力，菌株生長達到成熟期侵入到宿主體內(nèi)造成的危害遠大于其它時期。

P.expansum的寄生能力較弱，通過宿主的傷口組織侵入后，自身的菌齡以及外界環(huán)境條件如溫度和濕度等都會影響后續(xù)的侵染速度和發(fā)病程度。Mersha等人研究發(fā)現(xiàn)假尾孢葉斑?。≒seudocercospora fuligena）侵染番茄時菌齡為7 d的發(fā)病率比21 d的高出50%，在28℃的潮濕環(huán)境中潛育期最短[12]。王翠翠等發(fā)現(xiàn)套袋蘋果黑點病病原菌 （Alternariatenuissima）在29.4℃時侵染速度最快[13]。陸寧海等人的研究結果表明，溫度和濕度持續(xù)時間對P.italicum侵染柑橘具有較大的影響[14]。目前對于柑橘采后病原菌侵染的研究主要以指狀青霉（P.digitatum）[15]和意大利青霉（P.italicum）為主，而對P.expansum侵染柑橘條件的研究還未見相關文獻報道。作者所在實驗室前期從腐爛柑橘傷口處篩選得到一株致病菌H1，經(jīng)鑒定，確定為擴展青霉，命名為P.expansumH1[16]。目前還沒有菌齡、溫度和濕度等條件影響P.expansum侵染柑橘的報道，因此，作者對P.expansumH1侵染柑橘能力的影響因素進行了研究，以期為防治P.expansum的侵染提供必要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

電子顯微鏡：購于江南光學儀器廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱：購于上海恒一科技有限公司；GR85DR型全自動高壓滅菌鍋：購于致微（廈門）儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：購于蘇州凈化設備有限公司；血球計數(shù)板：購于丹陽市健陵醫(yī)療器械公司。試驗所用試劑：均購于鎮(zhèn)江華東化玻有限公司。

1.2 菌懸液的制備

試驗所用菌種P.expansumH1系從江蘇省鎮(zhèn)江市江心洲生態(tài)果園收集的腐爛柑橘傷口處分離純化得到。將P.expansumH1接種于PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，加水煮沸20 min，過濾后往濾液中加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂，蒸餾水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min）上活化，25℃培養(yǎng)7 d，用接種環(huán)挑取孢子至無菌生理鹽水中，振蕩混勻，用無菌槍頭吸取菌懸液從蓋玻片側邊滴于血球計數(shù)板上，吸掉蓋玻片外多余液體，在10×40倍顯微鏡下計算菌懸液的孢子濃度，調(diào)整孢子濃度至1×106個/mL備用。

1.3 柑橘果實

柑橘（廣西蜜桔）選用果園中成熟度一致，外觀色澤大小均一且表面無機械損傷的果實，先用清水將柑橘表面塵土等沖掉，再浸入到0.3%的NaClO中殺菌消毒2 min，最后用清水沖洗干凈，室溫下自然晾干。在柑橘赤道位置用滅菌打孔器打3個相同均勻分布的傷口（5 mm×3 mm）備用。

1.4 溫度對P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

在柑橘傷口處加入30 μL濃度為1×106個/mL的P.expansumH1的菌懸液，2 h后用保鮮膜密封裝有柑橘的筐子，分別置于 4、10、15、20、25、30、35 ℃，95%RH恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。每個筐中放12個柑橘，每個處理3個平行，整個試驗重復3次，逐日觀察統(tǒng)計潛育期和柑橘腐爛情況。

1.5 保濕時間對P.expansumH1侵染柑橘能力的影響

在柑橘傷口處加入30 μL濃度為1×106個/mL的P.expansumH1的菌懸液，2 h后將浸有5 mL無菌水的加濕棉球放入裝有柑橘的筐子中。密封后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中。保濕時間設置為8、16、24、32、40、48 h，完畢后移去加濕棉球。每個筐中放12個柑橘，每個處理3個平行，整個試驗重復3次。逐日統(tǒng)計腐爛情況和潛育期，每隔24小時記錄柑橘腐爛情況。

1.6 菌齡對P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

在柑橘傷口處加入 30 μL 不同菌齡（3、7、11、15、19 d）濃度為 1×106個/mL 的P.expansumH1 的菌懸液，密封后放置于25℃、95%RH恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。每個筐中放12個柑橘，每個處理3個平行，整個試驗重復3次，分別在第4、7、10天觀察統(tǒng)計柑橘腐爛情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗進行3次生物學重復，以實驗數(shù)據(jù)平均值±均值標準誤差（mean±SEM）表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析采用SPSS 16.0軟件的Student's t檢驗或One-Way ANOVA的Tukey’s檢驗。P值小于0.05被認定為數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 溫度對P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

溫度對P.expansumH1侵染柑橘能力的影響見表 1和圖 1-2。由表 1可知，溫度對于P.expansumH1侵染的速度有較大影響。柑橘在25℃時35～40 h已經(jīng)開始發(fā)??；其次是20℃，潛育期為43～48 h；15℃時潛育期是67～72 h；10℃和35℃潛育期最長，為72～77 h（除4℃外）。圖1-2的結果顯示，25℃時柑橘的腐爛率和腐爛直徑在48、72、96 h始終高于其他溫度，處于4℃的柑橘在試驗期間并未腐爛。48 h時20、25、30℃柑橘已經(jīng)開始腐爛，其它溫度的柑橘并未腐爛。72 h時所有溫度的柑橘都已腐爛，25℃的柑橘腐爛率達到90.3%，是35℃的10.8倍，腐爛直徑為12.7 mm （傷口直徑是3 mm），其次是20℃和30℃，腐爛率為 80.6%和72.2%，腐爛直徑為10.9 mm和9.7 mm。96 h時25℃的柑橘腐爛率高達98%，幾乎已經(jīng)全部腐爛，腐爛直徑為19.9 mm。以上結果表明，P.expansumH1在25℃時潛育期最短，侵染柑橘的能力最強，4℃時P.expansumH1侵染柑橘的能力受到抑制。

表1 溫度對柑橘發(fā)病潛育期的影響Table 1 Effects of temperature on infection incubation period of citrus

圖1 溫度對P.expansum H1侵染柑橘腐爛直徑的影響Fig.1 Effects of temperature on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

圖2 溫度對P.expansum H1侵染柑橘腐爛率的影響Fig.2 Effects of temperature on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

2.2 保濕時間對P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

不同保濕時間對P.expansumH1侵染柑橘能力的影響見圖3-4。可以看出，濕度對于P.expansumH1的侵染能力也有很大影響。在第48小時，保濕時間為8 h的柑橘腐爛率為12.5%；保濕時間為48 h的腐爛率高達86%，腐爛直徑為11.2 mm，是保濕8 h的2倍左右；96 h后保濕8 h的柑橘腐爛率為93%，腐爛直徑是12.4 mm；保濕時間32 h以上的柑橘腐爛率全部達到100%，腐爛直徑在16 mm以上，最高達21.3 mm。從時間節(jié)點分析，保濕48 h的柑橘腐爛直徑擴展的速度較快。以上結果表明，保濕時間越長，越有利于P.expansumH1侵染柑橘，柑橘腐爛率越高，腐爛直徑越大。

圖3 保濕時間對P.expansum H1侵染柑橘腐爛直徑的影響Fig.3 Effects of wetness duration on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

圖4 保濕時間對P.expansum H1侵染柑橘腐爛率的影響Fig.4 Effects of wetness duration on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

2.3 菌齡對P.expansum H1侵染柑橘能力的影響

菌齡對P.expansumH1侵染柑橘能力的影響見圖5-6。不同菌齡的P.expansumH1侵染柑橘的能力有較大區(qū)別。培養(yǎng)7 d的P.expansumH1對柑橘的侵染能力最強，在第4、7、10天的腐爛率和腐爛直徑始終高于其它處理組。第4天時接種培養(yǎng)7 d的P.expansumH1的柑橘腐爛直徑為11.3 mm，腐爛率已經(jīng)達到80%，是培養(yǎng)3 d菌株的5倍；第10天時柑橘腐爛率的大小依次為培養(yǎng)7 d（99.3%）＞培養(yǎng)11 d（88.6%）＞培養(yǎng) 15 d（71.6%）＞培養(yǎng) 19 d（63.7%）＞培養(yǎng)3d（59.3%），且培養(yǎng)7 d的腐爛直徑也最高，為30.2 mm。以上結果表明，培養(yǎng)7 d的P.expansumH1侵染能力最強，培養(yǎng)11 d的次之，培養(yǎng)3 d的最弱。值得注意的是，P.expansumH1在培養(yǎng)19 d后雖致病力下降，但依然可以引起柑橘腐爛，具有較強的侵染能力。

圖5 菌齡對P.expansum H1侵染柑橘腐爛直徑的影響Fig.5 Effects of fungus age on the rot diameter of citrus infected by P.expansum H1

圖6 菌齡對P.expansum H1侵染柑橘腐爛率的影響Fig.6 Effects of fungus age on the disease incidence of P.expansum H1 infecting citrus

3 結 語

P.expansum可引起柑橘采后綠霉病的發(fā)生，是除P.italicum和P.digitatum外造成柑橘腐爛的另一主要致病菌。作者研究了不同溫度、保濕時間以及菌齡對P.expansumH1侵染柑橘能力的影響。實驗結果表明，溫度、保濕時間和菌齡對P.expansumH1侵染柑橘的能力都有很大影響。通過腐爛率、腐爛直徑及潛育期的測定結果發(fā)現(xiàn)，P.expansumH1在25℃時潛育期最短，侵染柑橘的能力最強，4℃時P.expansumH1侵染柑橘的能力受到抑制。同時，保濕時間越長，越有利于P.expansumH1侵染柑橘，柑橘腐爛率越高，腐爛直徑越大。此外，培養(yǎng)7 d的P.expansumH1侵染柑橘的能力最強。陸寧海等的研究發(fā)現(xiàn)，P.italicum的菌齡和外界環(huán)境條件如溫度、保濕時間都會影響柑橘青霉?。≒.italicum）的發(fā)病[14]，本研究結果與其基本一致。菌齡為7 d的P.expansumH1在25℃、保濕時間48 h時最適宜侵染柑橘發(fā)病，說明該菌侵染需要較高的溫度和較長的保濕時間。培養(yǎng)3 d的菌株致病性較弱，可能是由于培養(yǎng)時間較短，P.expansumH1致病能力不足。柑橘在長時間的運輸和貯藏過程中溫度和濕度都會升高，為P.expansum的侵染提供了有利的條件，這可能是近年來P.expansum引起的柑橘采后病害日益嚴重的原因。因此在柑橘采后運輸貯藏過程中應及時通風降溫除濕，以有效控制P.expansum的生長繁殖。