佛手果醋乙醇發酵優良酵母菌的選育及鑒定

朱佳琪， 鄭飛云， 楊 悅， 王金晶， 劉春鳳， 鈕成拓，王海鳴， 楊惠成， 李永仙*， 李 崎

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122；2.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東 廣州，510656）

佛手屬蕓香科柑橘屬，其性狀與柑橘、柚子等果木類似[1]。佛手含有豐富的礦物元素和多種生理活性物質，尤其是其含有的檸檬苦素類化合物具有抗癌、抗菌、抗瘧藥等藥理作用[2-3]。目前佛手主要被用作景觀和藥材，深加工產品種類較少[4]。作者首次利用佛手汁為原料，經乙醇發酵和醋酸發酵得到果醋飲料。

目前水果醋的乙醇發酵階段主要使用安琪葡萄酒酵母，工業上尚無用于佛手果醋乙醇發酵的專用酵母。在已有的果醋乙醇酵母的篩選中，大多只涉及乙醇發酵階段[5-6]，在選育過程中與醋酸發酵結合的選育方式鮮有報道，兩個發酵階段的結合能否產生有益的效果更值得人們探索。乙醇發酵是生產果醋的第一步[7]，乙醇的積累、香氣的形成以及有機酸含量的增減都對果醋成品的品質起著非常重要的作用。同時為避免檸檬苦素對酵母發酵能力的影響，篩選一株能適應佛手發酵環境、產乙醇能力強、起發速度快、風味優良、益于醋酸發酵的酵母菌對佛手果醋的工業化生產具有重要意義。作者利用市售佛手，從其自然發酵的汁液中分離篩選適合乙醇發酵的優良酵母，得到了一株發酵性能、香氣均優良且能與醋酸菌較好結合的酵母菌，并對其進行了菌株鑒定、風味測定和耐受性驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佛手汁、白砂糖、安琪葡萄酒干酵母粉、食用乙醇：市售；瓊脂粉、蛋白胨、酵母粉：Thermo Fisher Oxoid；葡萄糖、氯化鈉、磷酸二氫鈉：國藥集團藥品。酵母基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技 （北京）有限公司；巴氏醋酸菌：作者所在實驗室保藏。

AMP溶液：1 g氨芐青霉素溶于10 mL蒸餾水中，并用濾膜過濾，-20℃保存，以抑制細菌生長。

YPD富集培養基：葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，瓊脂粉2 g，自然pH，蒸餾水定容至100 mL，115℃滅菌15 min，滅菌后待培養基冷卻后加入AMP 100 μL。

產酯初篩培養基：酵母粉1 g，瓊脂2 g，蒸餾水定容至100 mL，pH 6.8～7，115℃滅菌15 min，滅菌后待培養基冷卻后加入溴甲酚紫0.04 mg，乙酸乙酯0.1 mL，乳酸乙酯0.1 mL。

YPD固體培養基：葡萄糖 2 g，蛋白胨 2 g，酵母粉 1 g，瓊脂粉 2 g，自然pH，蒸餾水定容至100 mL，115℃滅菌15 min。

醋酸菌種子培養基：葡萄糖 1 g，酵母粉1 g，pH 5.5，115℃滅菌15 min，滅菌后待培養基冷卻后加入乙醇（食用級）5 mL。

關于魯迅的短篇小說《藥》，已經有不少學者從影響研究的層面探討了俄蘇作家，如果戈理、契訶夫、屠格涅夫、安特萊夫等對魯迅的影響。老師可以選取一二篇有代表性的學術論文，讓學生閱讀，并體會影響研究的方法和步驟。

1.2 儀器與設備

低溫水浴槽、生化培養箱 BSP-250：上海博迅公司；阿貝折光儀：山東泰光電氣有限公司；PL2002電子天平、便攜式pH計、AL204分析天平：METTLER TOLEDO儀器有限公司；氣相色譜串聯質譜聯用儀：美國瓦里安公司；高效液相色譜（Chromaster）：日本HITACHI公司。

1.3 研究方法

1.3.1 菌種富集與分離 取250 mL新鮮佛手汁于500 mL無菌的三角瓶中，于28℃恒溫自然發酵。待三角瓶中出現大量氣泡并伴有酒香時，取10 mL發酵液接入YPD富集培養基，28℃靜置培養2 d。將菌懸液稀釋涂布于產酯初篩培養基，28℃培養2 d。挑取單菌落至YPD斜面，培養后于4℃保存。

1.3.2 酵母菌的初篩 利用杜氏小管法進行酵母菌初篩。試管中佛手汁體積10 mL，接入酵母培養液，接種濃度2.5×107CFU/mL，28℃靜置培養2 d。根據觀察杜氏小管中氣柱的高低以及對各菌株的香氣感官品評，初步篩選出發酵能力強、發酵香氣宜人的酵母菌株。

1.3.3 酵母菌的復篩 將初篩所得的菌株活化后接入含糖18°Bx的250 mL佛手汁中，接種濃度2.5×107CFU/mL，25℃發酵7 d，以安琪葡萄酒酵母為對照，比重瓶法測定發酵液的乙醇體積分數。香氣感官評價[8]：組織品評小組（由具有相關專業背景、受過專業訓練的教師6人和學生14人組成）對乙醇發酵液進行香氣品評，品評結果取平均值。發酵氣味好、佛手柑橘香與酒香協調、諸香和諧純正，滿分10分。在后續的研究過程中若無特別說明，酵母的接種濃度和發酵條件與本方法一致。

1.3.4 酵母菌三級篩選

1）酵母菌起酵速度篩選 將復篩所得產乙醇能力強的酵母進行500 mL三角瓶發酵，以安琪葡萄酒酵母為對照。每日稱質量，計算CO2質量的減少。根據48 h CO2質量減少的總量判斷酵母菌的起酵速度。

2）乙醇發酵液和醋酸發酵中的主要有機酸含量分析 將所得到的產乙醇能力強且起酵速度快的酵母菌株進行500 mL三角瓶發酵，發酵液于4 000 r/min，離心5 min，去除酵母，將發酵上清液置于新滅菌500 mL空瓶中，接入巴氏醋酸菌接種濃度為6×106CFU/mL，轉速150 r/min，37℃培養5 d。 離心取上清液，經0.22 μm膜過濾后，利用液相高效色譜測定各類有機酸含量。色譜條件如下，色譜柱：XBridge C18 4.6×150 mm；柱溫：30 ℃；紫外檢測器：220 nm；流動相：0.02 mol/L NaH2PO4pH 2.7； 進樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min。

1.3.5 菌株鑒定 取-80℃甘油貯存液接種于100 mL YPD培養基中，接種濃度5×106CFU/mL，28℃、150 r/min培養24 h。取適量培養液離心 1 min（12 000 r/min），棄上清液，采用試劑盒法提取菌體DNA。用酵母 ITS通用引物對正向引物ITS1、反向引物 ITS4擴增基因組 DNA。PCR產物用2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，并進行測序。用BLAST方式將測定的18S rDNA序列與GenBank中酵母菌的序列進行比對，構建系統發育樹。

1.3.6 酵母菌株發酵液中主要風味成分分析 將所得菌株與安琪葡萄酒酵母進行對比發酵，分析乙醇發酵液中的風味成分。發酵結束后采用氣相色譜-質譜（GC-MS）分析佛手乙醇發酵液的香氣成分。

樣品前處理萃取條件如下：20 mL頂空瓶中加入5 mL佛手酒樣品，1.0 g NaCl在45℃條件下預熱5min，萃取60 min。萃取完成后，將萃取頭插入進樣口，解吸附5 min，進行GC-MS分析[9]。分析條件同桑葚果酒GC-MS分析條件[10]。

風味成分評價方法：采用氣味活度值（Odor Activity Value，OAV）評價各化合物對樣品總體風味的貢獻，即OAV值為物質濃度與感覺閾值的比值。只有OAV＞1的揮發性化合物對總體風味有直接貢獻，并且在一定范圍內OAV值越大說明該物質對總體風味貢獻越大[11]。本研究僅分析OAV＞1的揮發性物質。

1.3.7 菌株耐受性驗證

1）糖度耐受性 將菌株分別接種于12、15、18、21、24 °Bx佛手汁中，接種濃度2.5×107CFU/mL，28 ℃培養3 d，每隔12小時取樣，測定600 nm下菌液的吸光值。

2）pH耐受性 調整初始佛手汁pH為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0， 接種濃度2.5×107CFU/mL，28 ℃培養3d，每隔12小時取樣，測定600 nm下菌液的吸光值。

3）乙醇耐受性 分別調整佛手汁初始乙醇體積分數為5%、8%、11%、14%、17%，接種濃度2.5×107CFU/mL，28℃培養3 d，每隔12小時取樣，測定600 nm下菌液的吸光值。

1.3.8 實驗數據處理與統計分析 各組實驗均做3次重復，采用“均值±標準差”表示實驗數據結果。使用SPSS20.0軟件對數據進行統計和差異性分析，顯著性界值為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 菌株的富集與分離

佛手汁經自然發酵、富集與分離，菌落都具有酵母的典型性特征：表面光滑，黏稠，乳白色，有酒香味，顯微鏡下呈橢圓形[12]。分離得到85株酵母菌株，經YPD斜面培養后于4℃保存備用。

2.2 酵母菌的初篩

采用杜氏小管法進行酵母菌株初篩，結果見表1和圖1。

表1 酵母初篩結果Table 1 Results of yeast screening

結果表明：1）有34株酵母經過發酵后，杜氏小管內充滿了氣泡，說明其發酵能力強[13]；2）有29株酵母發酵氣味優良，具備佛手酒發酵的柑橘清爽的香氣。如圖1所示，綜合產氣情況和發酵氣味這兩個指標分析，初篩得到29株發酵能力強且發酵氣味愉悅的酵母菌株。

圖1 酵母初篩結果維恩圖Fig.1 Venn diagram of yeast screening

2.3 酵母菌的復篩

乙醇產生能力的強弱是評價果酒酵母優劣的重要指標[14]。對初篩所得的29株酵母菌進行三角瓶發酵，發酵結束后測定其乙醇體積分數，并對發酵后酒樣進行香氣的感官品評，對照菌為安琪葡萄酒酵母，其發酵后乙醇體積分數為7.25%，香氣感官評價得分為5.5。以這兩個指標作為復篩的標準，篩選乙醇發酵度及感官評分均高于對照菌的酵母菌株，最終得到7株酵母， 編號分別為1-3、2-13、2-29、2-36、6-7、7-7、10-1，其乙醇體積分數和香氣感官評價得分見表2和圖2。

表2 酵母菌乙醇體積分數與香氣感官評價得分Table 2 Alcoholproduction capacity and sensory evaluation of the yeasts

圖2 酵母復篩結果維恩圖Fig.2 Venn diagram of yeasts’alcohol production capacity and sensory evaluation

2.4 酵母菌三級篩選

2.4.1 酵母菌起酵速度篩選 酵母菌株具有較快的起酵速度，能縮短發酵周期，對工業生產成本的節約有重要意義。酵母菌在乙醇發酵過程中將糖轉化為乙醇的同時會產生CO2，因此發酵初期CO2的釋放量的多少可以表示起酵速度的快慢[15]。對復篩所得的7株酵母進行三角瓶發酵，每日稱質量并計算CO2釋放量，對照菌為安琪葡萄酒酵母。發酵24 h與48 h CO2具體釋放量情況見表3。由表3可知，對照菌在48 h內的質量損失為4.83 g，大于對照菌，即起酵速度快于對照菌的菌株共有3株，分別為6-7、2-36、10-1，選取這3株菌進行下一步研究。

表3 酵母菌乙醇發酵48 h內CO2釋放量Table 3 CO2emission amount of the yeasts in 48 hours

2.4.2 乙醇發酵液和醋酸發酵液中的主要有機酸質量濃度分析 果醋中有機酸種類和質量濃度是評價果醋優劣的重要指標之一。種類豐富的有機酸能使果醋酸感柔和，緩解刺激感[16]。作者以安琪葡萄酒酵母為對照菌，利用2-36、6-7、10-1號菌在三角瓶中進行乙醇發酵，發酵結束后離心去除酵母菌體，接入巴氏醋酸菌繼續發酵。醋酸發酵結束后，測定各類有機酸質量濃度，結果見表4。

表4表明，不同種類的有機酸經過醋酸發酵后質量濃度有所變化，其中乙酸質量濃度變化最大，增加量約32 mg/mL。非揮發性酸略有增減。乙醇發酵液中乳酸、琥珀酸、酒石酸、蘋果酸等非揮發性有機酸質量濃度分別為4.29、4.24、4.64、4.57 mg/mL，其中菌株6-7和10-1產揮發酸性能較佳。非揮發性酸的增加能使醋酸發酵液酸味綿柔、減小刺激感。與6-7號菌對應的醋酸發酵液中，非揮發性有機酸質量濃度為5.06 mg/mL，相比于乙醇發酵液中的有機酸提高了9.05%，比安琪葡萄酒酵母高12.7%，而10-1菌株在經過醋酸發酵后非揮發性酸質量濃度沒有顯著變化。

菌株6-7在乙醇發酵過程中能產生更多的有機酸，且在經過醋酸發酵后，有機酸質量濃度進一步增加。因此，將6-7號菌定位為本研究的優選菌，命名為FS-ZJQ。

表4 乙醇發酵液和醋酸發酵液中的有機酸質量濃度Table 4 Contents organic acids in wine and vinegar

2.5 菌種鑒定

如圖3所示，菌株FS-ZJQ的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果良好。將測序結果與Genbank中酵母菌的18S rDNA序列比對，構建系統發育樹。本研究選擇了3種與FS-ZJQ堿基個數相似的、食品用酵 母 菌 ：Saccharomyces cerevisiae（KC183722.1、KX131151.1），Rhodotorula mucilaginosa（AF444541.1、AF444608.1），Pichiakudriavzevii（KX131152.1），Pichia membranifaciens（AY251639.1）。 如圖4所示，FS-ZJQ與釀酒酵母（S.cerevisiae）同源性為100%，可確定菌株FS-ZJQ為釀酒酵母。

圖3 酵母PCR產物瓊脂糖電泳圖Fig.3 Agarose electrophoresis of PCR products of yeast

2.6 酵母菌株發酵液中主要風味成分分析

將酵母菌株FS-ZJQ與安琪葡萄酒酵母于三角瓶中進行發酵，采用氣相色譜-質譜（GC-MS）分析佛手乙醇發酵液的香氣成分。由表5可知，不同的菌株經過乙醇發酵后，發酵產物中揮發性成分都有不同程度的變化。經FS-ZJQ發酵后，與安琪葡萄酒酵母相比，發酵液中萜烯類化合物質量分數為7.60%，萜烯類化合物種類有：α-萜品烯 （柑橘和檸檬香氣）、α-水芹烯（薄荷香氣）、β-水芹烯（青草香氣）[17]等9種。酯類化合物質量分數為6.04%，酯類化合物有：乙酸己酯（水果清甜氣味）、辛酸乙酯（水果香氣）、乙酸香葉酯（玫瑰薰衣草香氣）、乙酸苯乙酯（玫瑰花香）[17]等12種。酵母菌株決定了酯的形成量，同時不同酯的種類和數量決定了果醋的香氣和風味[18]。芳香族化合物基本得到保留，醇類與羰基化合物與對照菌質量分數相當。由此可見，FS-ZJQ揮發性香氣成分種類豐富，能適應佛手環境，產香能力優于安琪葡萄酒酵母。

圖4 基于18S rDNA測序構建酵母菌株系統發育樹Fig.4 PhylodenetictreeofSaccharomycescerevisiaebased on 18S rDNA sequencing

表5 發酵液中主要揮發性風味成分分析Table 5 Analysis of main volatile aroma components

2.7 FS-ZJQ菌株耐受性驗證

2.7.1 糖度耐受性 將FS-ZJQ接種于不同初始糖度的佛手汁中，培養過程中定期取樣測定菌液在600 nm測定吸光值。由圖5可知，0～24 h期間，當初始糖度低于21°Bx時，酵母生長速率隨著糖度的增加而加快，當糖度高于21°Bx時，其生長速率隨著糖度的增加而減緩，隨后趨于穩定。由此可知，FS-ZJQ能耐12～21°Bx的糖度，符合酵母菌乙醇發酵的12～20 °Bx的糖度范圍[19]。

2.7.2 pH耐受性 佛手汁的pH為4.2左右，故考慮FS-ZJQ在pH＜4的耐受性。將FS-ZJQ接種于不同初始pH的佛手汁中，培養過程中定期取樣測定菌液在600 nm測定吸光值。由圖6可知，當初始pH＜3時，酵母細胞的生長受到抑制；當pH 2時，抑制作用明顯。這是因為強酸條件會對細胞造成一定的損傷，導致生理活性的喪失。當初始pH在3～4時，酵母生長趨勢整體相似，生長速度均由快速趨于緩慢。由此可知，FS-ZJQ在pH為3～4時具有耐酸能力，符合酸類果汁乙醇發酵對pH的要求[20]。

2.7.3 乙醇耐受性 果酒乙醇體積分數一般為7%～13%[21]，將FS-ZJQ接種于不同初始乙醇體積分數的佛手汁中，培養過程中定期取樣測定菌液在600 nm處吸光值，結果見圖7。乙醇體積分數高于14%時，酵母生長受到抑制。當乙醇體積分數為5%、8%、11%時，酵母生長趨勢較為相似。0～24 h酵母生長緩慢；24～48 h生長明顯加快，隨后趨于穩定。這是因為初始培養基中的乙醇對酵母的生長產生了脅迫作用[22]，酵母生長進入遲滯期。24 h后酵母進入對數生長期，細胞濃度增加。36 h后酵母生長緩慢，乙醇的積累抑制了酵母的生長，最后趨于平穩。由此可知，FS-ZJQ在乙醇體積分數低于14%具有較強的耐受性。

圖7 不同乙醇體積分數下FS-ZJQ生長情況Fig.7 Growth curvesofFS-ZJQ with different alcohol concentrations

3 結 語

果醋釀造行業中，大多使用安琪葡萄酒酵母作為乙醇發酵階段菌株，但其特異性弱，并不能突出佛手原料特色。同時在篩選果醋乙醇酵母的過程中，與醋酸發酵結合的選育方式卻鮮有報道。本研究通過菌種富集、分離、初篩及復篩，并結合醋酸發酵實驗，最終得到一株酵母菌FS-ZJQ，其產乙醇能力強、起酵速度快、產香較好、非揮發性酸質量濃度相對較高，且經醋酸發酵后非揮發性酸質量濃度進一步提高。在糖度18°Bx的佛手汁中，25℃發酵7 d可產乙醇8.49%，乙醇產量比安琪葡萄酒酵母高17.1%；經醋酸發酵后，非揮發性酸質量濃度可達5.06 mg/mL，比安琪葡萄酒酵母高12.7%。經菌種鑒定FS-ZJQ為釀酒酵母；通過GC-MS風味分析，測得萜烯類化合物、酯類化合物分別占總揮發性風味成分的58.83%、16.44%，分別比安琪葡萄酒酵母高7.60%、6.04%；通過耐受性試驗可知，該酵母菌對糖度、pH、乙醇體積分數都具有一定的耐受性，能適應佛手汁環境，具有工業應用前景。