葡萄籽原花青素對(duì)豬背最長(zhǎng)肌肌苷酸和肌內(nèi)脂肪含量的影響

張 楠，暴雪艷，郝瑞榮，李清宏

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

近年來，我國養(yǎng)豬業(yè)向集約化和規(guī)模化發(fā)展，畜牧養(yǎng)殖業(yè)中藥物濫用已成為普遍現(xiàn)象，這些藥物在動(dòng)物體內(nèi)蓄積形成藥物殘留和細(xì)菌耐藥性[1]，原花青素是從植物中提取的活性成分，作為天然植物飼料添加劑已成為養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。原花青素具有抗氧化、降低血清膽固醇、肝臟膽固醇、甘油三酯的功能，能維持血漿中膽固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL）的含量，改善血脂異常[2]，它是由不同數(shù)量的兒茶素、表兒茶素和沒食子酸通過C4-C6或C4-C8鍵縮合而成的多聚體[3]。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSPs）是提取于葡萄籽中的一類植物源性多酚化合物。左晟希[4]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在AA肉雞飼料中添加一定量的原花青素、茶多酚，能顯著降低肌肉剪切力、提高肌肉干物質(zhì)含量，改善肉質(zhì)。汪水平等[5]研究表明，原花青素可降低兔肉肌肉組織的粗脂肪含量，改善兔肉肉品的物理性狀。隨著對(duì)原花青素研究的深入，人們逐漸重視起原花青素作為飼料添加劑對(duì)肉品質(zhì)的影響，但在豬肉方面研究較少。

本試驗(yàn)通過在飼料中添加不同含量的葡萄籽原花青素，檢測(cè)其與豬肉品質(zhì)相關(guān)的肌苷酸（IMP）和肌內(nèi)脂肪含量（IMF）的影響，及與IMP和IMF相關(guān)基因（腺苷酸琥珀酸裂解酶基因（ADSL）、腺苷-磷酸脫氨酶基因（AMPD1）、二酰基甘油轉(zhuǎn)移酶1基因（DGAT1）、脂蛋白脂酶基因（LPL））的表達(dá)量，為葡萄籽原花青素在飼料中的添加量提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用豬為平均體質(zhì)量在25 kg左右的杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬，共48頭；供試葡萄籽原花青素（GSPs）（95%）含79.28%的低聚原花青素，購于天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；供試玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧參照NRC（2012）營養(yǎng)需要配制，日糧組成和營養(yǎng)成分含量列于表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)成分含量

主要儀器：高速冷凍離心機(jī)（德國，Eppendorf AG）；普通PCR擴(kuò)增儀（美國，賽默飛世兒科技公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國，Stratagene）；超凈工作臺(tái)BCM-1000（蘇州，蘇信環(huán)境科技有限公司）；微量移液器（德國，Eppendorf AG）；超純水制水儀（香港，力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)）；超低溫冰箱（美國，賽默飛世兒科技公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（河北，北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

豬隨機(jī)分為4組：Ⅰ組.基礎(chǔ)日糧（CK）；Ⅱ組.基礎(chǔ)日糧+100 mg/kg GSPs；Ⅲ組.基礎(chǔ)日糧＋150 mg/kg GSPs；Ⅳ組.基礎(chǔ)日糧+200 mg/kg GSPs。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬。飼養(yǎng)試驗(yàn)期間，試驗(yàn)豬自由采食和飲水，預(yù)先試驗(yàn)7 d，正式試驗(yàn)28 d，按照豬場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行驅(qū)蟲和免疫。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，禁食12 h，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3頭豬屠宰，取背最長(zhǎng)肌、肝臟、心臟組織裝入2 mL凍存管，迅速浸入液氮中，再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱，用于肌苷酸、肌內(nèi)脂肪含量的測(cè)定和總RNA的提取。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 IMP含量 采用高效液相色譜法測(cè)定，流動(dòng)相0.05 mol/L，pH＝6.5，甲酸銨溶液（含5%甲醇）；進(jìn)樣量10μL；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣溫度30℃。

1.3.2 IMF含量 采用索氏提取法（GB/T 5009.6—2003）測(cè)定。

1.3.3 IMP和IMP相關(guān)基因的檢測(cè)

1.3.3.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 在無菌條件下提取RNA，用微量核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行濃度、純度以及A260/A280（R值）的檢測(cè)，質(zhì)量好的RNA的R值在1.8～2.0，小于1.8說明有蛋白質(zhì)污染，大于2.0說明RNA部分降解。按照Prime ScriptTMRT Rragent kit with gDNA Earser（Perfect Real Time）試劑盒說明書進(jìn)行操作，在無菌條件下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.3.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上已公布的ADSL、AMDP1、DGAT1、LPL和內(nèi)參基因β-actin的序列，用Primer 3 Plus引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物序列，由上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行引物合成。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度列于表2。

表2 目的基因與內(nèi)參基因引物序列

1.3.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立 按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，用反轉(zhuǎn)錄出的cDNA進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)條件，選擇引物最適退火溫度和調(diào)整cDNA濃度。反應(yīng)條件：95℃條件下預(yù)變性30 s；以95℃5 s、60℃30 s為循環(huán)條件進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。試驗(yàn)所用反應(yīng)體系列于表3。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔT法計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果，所有數(shù)據(jù)均以SPSS17.0軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，以LSD法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSPs對(duì)豬背最長(zhǎng)肌中IMP和IMF含量的影響

表4 日糧添加GSPs對(duì)豬背最長(zhǎng)肌中IMP和IMF含量的影響

從表4可以看出，與空白組相比，添加GSPs的3個(gè)試驗(yàn)組背最長(zhǎng)肌中的IMP含量均極顯著增加（P＜0.01），各組間差異顯著（P＜0.05）；隨著GSPs添加量的增加，IMP含量先增加后減少，其中，Ⅲ組IMP含量最高。與空白組相比，3個(gè)試驗(yàn)組背最長(zhǎng)肌中的IMF含量極顯著降低（P＜0.01），各組間差異極顯著（P＜0.01）；隨著GSPs添加量的增加，IMF含量先減少后增加再減少，其中，Ⅳ組IMF含量最少。

2.2 GSPs對(duì)豬背最長(zhǎng)肌、肝臟和心臟中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

各組豬背最長(zhǎng)肌、肝臟和心臟中IMP的相關(guān)基因表達(dá)列于表5。從表5可以看出，與空白組相比，腺苷酸琥珀酸裂解酶基因（ADSL）在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量降低，各組間差異極顯著（P＜0.01），在添加GAPs的組中，Ⅲ組表達(dá)量最高；在肝臟中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），Ⅳ組表達(dá)量顯著高于其他3組；在心臟中，各試驗(yàn)組表達(dá)量差異顯著（P＜0.05），其中，Ⅳ組極顯著高于其他組，Ⅲ組極顯著低于其他組。與空白組相比，腺苷-磷酸脫氨酶基因（AMPD1）在背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），Ⅳ組表達(dá)量顯著低于其他3組，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著，Ⅰ組和Ⅳ組與Ⅱ、Ⅲ組間差異顯著（P＜0.05）；在肝臟中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），Ⅰ、Ⅳ組的表達(dá)量差異不顯著，Ⅳ組表達(dá)量顯著高于Ⅱ、Ⅲ組；在心臟中，Ⅰ、Ⅱ組的表達(dá)量均顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05），其中，Ⅱ組表達(dá)量極顯著高于其他組（P＜0.01）。

表5 豬背最長(zhǎng)肌、肝臟和心臟中IMP相關(guān)基因表達(dá)

各組豬背最長(zhǎng)肌、肝臟和心臟中IMF的相關(guān)基因表達(dá)列于表6。從表6可以看出，二酰基甘油轉(zhuǎn)移酶1基因（DGAT1）mRNA的表達(dá)量在背最長(zhǎng)肌中隨GSPs添加量的增加而減少，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組間表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05），Ⅳ組表達(dá)量顯著低于Ⅰ、Ⅱ組（P＜0.05），雖然也低于Ⅲ組但差異不顯著；在肝臟中，Ⅰ、Ⅳ組間表達(dá)量差異不顯著，與其他2組相比，表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01），Ⅱ組表達(dá)量極顯著高于其他組，Ⅲ組表達(dá)量極顯著低于其他組（P＜0.01）；在心臟中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組間表達(dá)量差異不顯著，Ⅲ組表達(dá)量顯著低于其他組（P＜0.05）。LPL mRNA的表達(dá)量在背最長(zhǎng)肌中Ⅰ、Ⅱ組間差異不顯著，Ⅲ組表達(dá)量極顯著高于Ⅰ、Ⅳ組（P＜0.01）；Ⅳ組表達(dá)量極顯著低于Ⅱ、Ⅲ組；在肝臟中，Ⅱ組表達(dá)量低于Ⅰ、Ⅳ組，但與Ⅲ組間差異不顯著，Ⅳ組表達(dá)量顯著高于其他組（P＜0.05）；在心臟中，Ⅱ、Ⅲ組間差異不顯著，Ⅰ、Ⅳ組間差異不顯著，但Ⅱ、Ⅲ組的表達(dá)量顯著低于Ⅰ、Ⅳ組。

表6 豬背最長(zhǎng)肌、肝臟和心臟中IMF相關(guān)基因表達(dá)

3 討論

3.1 GSPs對(duì)豬背最長(zhǎng)肌IMP含量及心臟、肝臟中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

人們研究發(fā)現(xiàn)，多肽類和核苷酸是肉類和肉制品鮮味的主要來源，其中，肌苷酸（IMP）是最強(qiáng)的鮮味物質(zhì)，已成為評(píng)定肉質(zhì)鮮美的重要指標(biāo)[6]。IMP在體內(nèi)有著十分復(fù)雜的代謝過程，這其中有10種關(guān)鍵酶的參與。腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）主要催化AMP合成的由SACIAR生成AICAR的反應(yīng)和由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸單磷酸的反應(yīng)，ADSL基因的表達(dá)可調(diào)控IMP含量[7]。腺苷-磷酸脫氨酶（AMPD1）催化AMP脫氨生成IMP。肌苷酸的含量受動(dòng)物的品種、飼料、飼養(yǎng)環(huán)境、屠宰時(shí)間、肌肉酸堿度、屠宰后處理等因素的影響[8-10]。

曹少奇等[11]對(duì)巨型玫瑰冠雞的研究表明，ADSL基因的表達(dá)與IMP含量顯著相關(guān)，它的高表達(dá)可提升IMP含量。STRATIL等[12]研究報(bào)道，AMDP1基因定位于豬與肉質(zhì)胴體性狀相關(guān)的QTL位點(diǎn)上，可將其作為豬胴體性狀的候選基因研究。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在日糧中添加GSPs的各組背最長(zhǎng)肌中IMP的含量顯著增加，在添加量為150 mg/kg的組中IMP含量高于其他組。以空白組為對(duì)照，ADSL基因的mRNA表達(dá)量在背最長(zhǎng)肌中添加GSPs的組中顯著低于空白組，添加量為100 mg/kg的組表達(dá)量顯著低于其他組，在肝臟和心臟中GSPs添加量為200 mg/kg時(shí)表達(dá)量顯著高于其他組；AMDP1基因的mRNA表達(dá)量在背最長(zhǎng)肌中添加GSPs的組中同樣極顯著低于空白組，添加量為200 mg/kg的組表達(dá)量顯著低于其他組，但在肝臟中200 mg/kg添加量的組表達(dá)量最高，在心臟中100 mg/kg添加量的組表達(dá)量極顯著高于其他組。這說明在日糧中適量添加GSPs有助于肌肉中IMP含量的增加，同時(shí)，添加濃度的不同對(duì)IMP相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)量影響各異。

3.2 GSPs對(duì)豬背最長(zhǎng)肌IMF含量及心臟、肝臟中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

肌內(nèi)脂肪（IMF）是沉積于肌肉組織的白色脂肪，由肌內(nèi)脂肪組織和肌纖維中的脂肪組成。IMF的含量主要影響肉的嫩度、大理石紋評(píng)分、滴水損失，IMF含量越高，脂肪含量越多，肉的嫩度越好，大理石紋評(píng)分升高，對(duì)滴水損失也有一定的保護(hù)[13-14]。二酰基甘油轉(zhuǎn)移酶1（DGAT1）是甘油三酯合成過程中的唯一關(guān)鍵酶，催化脂肪細(xì)胞甘油三酯合成反應(yīng)的最后一步。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)牛的DGAT1基因遺傳多態(tài)性研究較多，有研究表明，德國荷斯坦牛和夏洛萊牛的背最長(zhǎng)肌和半肌腱中的肌內(nèi)脂肪與K232A變異位點(diǎn)顯著相關(guān)[15]。脂蛋白脂酶（LPL）能將極低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯催化水解為脂肪酸，以供各組織儲(chǔ)存利用。除游離脂肪酸與血清蛋白結(jié)合形成可溶性復(fù)合物在血液中運(yùn)輸以外，其余都是以脂蛋白形式在血液中運(yùn)輸，LPL對(duì)脂肪運(yùn)輸有重要的調(diào)節(jié)作用，其活性高低是脂肪沉積的重要指標(biāo)[16]。有研究表明，萊蕪黑豬LPL mRNA的高表達(dá)對(duì)肌內(nèi)脂肪含量增加有積極的影響[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，在日糧中添加GSPs的各組背最長(zhǎng)肌中IMF的含量極顯著降低，在添加量為150 mg/kg的組中IMF含量高于其他添加組。以空白組為對(duì)照，DGAT1基因的mRNA表達(dá)量在背最長(zhǎng)肌中添加GSPs的組中低于空白組，添加量為200 mg/kg的組表達(dá)量最低，在肝臟和心臟中GSPs添加量為150 mg/kg時(shí)表達(dá)量顯著低于其他組；LPL基因的mRNA表達(dá)量在背最長(zhǎng)肌中GSPs添加量為200 mg/kg的組中顯著低于其他組，但在肝臟中200 mg/kg添加量的組表達(dá)量顯著高于其他組，在心臟中100 mg/kg添加量的組表達(dá)量最低。這說明在日糧中添加GSPs會(huì)減少肌肉中IMF的含量，同時(shí)，對(duì)IMF相關(guān)基因在不同組織的表達(dá)量上有一定的影響。馬蕾等[18]研究表明，山楂原花青素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠具有降脂作用。李德鵬等[19]研究表明，GSPs對(duì)綿羊脂肪細(xì)胞的生脂過程具有抑制作用，對(duì)前脂肪細(xì)胞的分化具有抑制作用。以上研究從不同方面說明了原花青素有降低動(dòng)物體內(nèi)脂肪含量的作用，與本試驗(yàn)結(jié)果類似，在本試驗(yàn)中，GSPs對(duì)IMF相關(guān)基因mRNA的表達(dá)量有一定的影響，但趨勢(shì)并不完全一致。在后續(xù)試驗(yàn)中可對(duì)GSPs影響IMF含量的機(jī)制做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

GSPs因具有抗氧化性、清除自由基、提高免疫力等作用而大受人們關(guān)注，作為天然添加劑在飼料中有廣泛的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在生長(zhǎng)豬日糧種添加GSPs，有效提高了豬背最長(zhǎng)肌中IMP的含量，降低了IMF的含量，并發(fā)現(xiàn)日糧中GSPs添加量為150 mg/kg較為合理，此時(shí)，IMP含量最高，IMF含量適中；對(duì)IMP、IMF相關(guān)基因的表達(dá)量也有明顯的影響，但作用機(jī)制尚未明確，需做進(jìn)一步的研究。