亞慢性砷暴露對小鼠心肌細胞凋亡的影響

李瑞華，韓明盛，胡 鑫，馬艷琴

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

砷（As）是一種天然存在的類金屬，幾乎存在于所有環境介質中，如空氣、土壤和水。其中，通過砷污染的地下水造成的慢性砷中毒嚴重威脅人類和動物健康[1-2]。砷一旦被吸收就會分布到肝、肺、腸壁、脾臟和心臟等器官，對機體造成危害[3]。給予小鼠腹腔注射三氧化二砷（5 mg/（kg·d））10 d，可引起心電圖ST段抬高和QT間期延長，心肌氧化應激增加，抗氧化防御能力下降，心肌膜損傷和炎性因子釋放[4]。胚胎期亞慢性砷暴露會導致胎鼠心臟畸形，包括室間隔缺損、房間隔缺損和法洛三聯征[5]。大鼠胚胎期至青春期砷染毒可導致大鼠收縮壓和舒張壓升高，心肌細胞發生腫脹、變性等組織病理學改變，電鏡超微結構觀察到心肌細胞線粒體、閏盤、細胞核均發生不同程度改變[6]。然而對于砷引起心臟毒性機制的認識還不深入。

本試驗選用C57BL/6小鼠作為試驗對象，通過飲水砷暴露建立亞慢性砷中毒小鼠模型，利用全自動生化分析儀檢測血清心肌酶譜水平，評估心肌損傷情況，并采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，采用實時熒光定量PCR技術檢測凋亡通路相關基因的表達，為進一步探討砷致小鼠心肌損傷的機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

選取40只5周齡、體質量為20～22 g的SPF級雄性C57BL/6小鼠用于試驗。小鼠購自斯貝福（北京）生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 預飼7 d后，40只小鼠隨機分為對照組及低、中、高劑量砷暴露組，自由飲食和采水。對照組小鼠飲去離子水，低、中、高劑量組分別飲含0.15、1.50、15.00 mg/L三氧化二砷（As2O3）的去離子水。試驗周期為90 d。所有試驗均符合山西農業大學實驗動物倫理委員會的章程。

試驗結束后，小鼠稱質量、麻醉，腹主動脈采血，收集血清于-20℃保存；同時分離心臟組織并稱質量，按照公式計算不同濃度砷暴露組間臟器系數后，液氮保存用于基因表達檢測；部分心臟置于4%多聚甲醛中固定，用于石蠟切片制作。

1.2.2 血清心肌酶活性測定 采用全自動生化分析儀檢測血清心肌酶活力，其中，肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、α-羥基丁酸脫氫酶（HBDH）采用速率法測定；谷草轉氨酶（AST）采用蘋果酸脫氫酶法測定。

1.2.3 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡率 心臟組織常規制作石蠟切片，脫蠟至水，利用生物素標記的dUTP（Biotin-dUTP）結合到切片中凋亡細胞DNA暴露的3′-OH端，隨后和辣根過氧化物酶（HRP）標記的Streptavidin（Streptavidin-HRP）結合，最后在HRP的催化下通過DAB顯色，于顯微鏡下觀察凋亡心肌細胞。每個樣本隨機選取5個高倍鏡視野進行細胞計數，計算凋亡率。

1.2.4 熒光定量PCR檢測心臟基因表達水平 采用Trizol法提取心臟總RNA，測定RNA純度和濃度。按試劑盒說明書進行反轉錄反應，SYBR Green法進行qRT-PCR，以β-actin為內參基因，采用2-ΔΔCt法分析Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的相對表達量。

1.3 數據分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計分析，組間差異采用one-way analysis of variance（ANOVA）進行分析，Dunnett法進行多重比較檢驗。

2 結果與分析

2.1 砷對小鼠心臟組織臟器系數的影響

攻毒90 d后，小鼠一般狀況良好，各組小鼠全部存活，采食量和飲水量未見明顯改變，毛色光亮，反應靈敏。從表1可以看出，不同濃度砷暴露組的小鼠心臟臟器系數均有所下降。其中，中劑量組與對照組相比差異顯著（P＜0.05），高劑量組與對照組間差異極顯著（P＜0.01）。

表1 不同濃度砷暴露對小鼠臟器系數的影響

2.2 砷對小鼠血清心肌酶活力的影響

表2 不同濃度砷暴露對小鼠血清心肌酶活力的影響 U/L

由表2可知，不同濃度砷暴露后，小鼠血清心肌酶活力與對照組相比，低劑量組各項指標無明顯改變，中、高劑量組血清AST、LDH、CK、HBDH活力均顯著升高，且隨染毒劑量的增加而增加。

2.3 砷暴露對小鼠心肌細胞凋亡及凋亡通路基因表達的影響

采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）檢測不同處理對小鼠心肌細胞凋亡的影響，結果如圖1所示。

由圖1可知，凋亡心肌細胞核呈棕黃至棕褐色，核形態為長橢圓形，胞質染色較淺。對照組中未發現有凋亡心肌細胞；低、中劑量組中偶見凋亡心肌細胞，多分布在心內膜、心外膜下，凋亡率分別為16.02%、10.64%；高劑量組凋亡心肌細胞的數量明顯增加，凋亡率達到24.2%。

采用熒光定量PCR方法檢測了不同濃度砷暴露小鼠心臟凋亡通路相關基因的表達量，結果如圖2所示。從圖2可以看出，與對照組相比，中、高劑量組促凋亡蛋白調節因子Bax的表達顯著升高，分別為對照組的1.24倍和1.31倍（P＜0.05）。抗凋亡蛋白調節因子Bcl-2的基因表達量在中、高劑量組均顯著降低，分別為對照組的88%（P＜0.05）和62%（P＜0.01）；高劑量組與低劑量組或中劑量組相比，表達量也顯著降低，差異具有統計學意義。不同濃度砷暴露后，凋亡效應分子Caspase-3的基因表達均升高，低劑量和中劑量組的相對表達量分別增加了22%和18%，但差異不顯著（P＞0.05）；高劑量組Caspase-3的相對表達量增加了46%，差異顯著（P＜0.05）。

3 結論與討論

3.1 砷暴露對小鼠血清心肌酶活力的影響

當心肌組織因多種原因發生炎癥、壞死時，心肌細胞中所含的酶類即可進入血液中。因此，血液中心肌酶譜的水平可反映心肌損傷的程度[7-8]。心肌酶譜的測定主要包括：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）、α-羥基丁酸脫氫酶（HBDH）等[9]。CK主要存在于骨骼肌和心肌中，是心肌中重要的能量調節酶[10]。AST也是體內最重要的氨基轉移酶之一，心肌中AST含量最為豐富[11]。血清CK、CK-MB、AST靈敏度和特異性均較高，已成為公認的反映心肌細胞損害的“金標準”[9]。LDH幾乎存在于所有組織中，以心臟、骨骼肌和腎臟中含量最為豐富。LDH增高主要見于肝炎和心肌梗死等，其同工酶存在明顯的組織特異性，可用于心肌疾病的診斷[12]。α-羥基丁酸脫氫酶（HBDH）的本質還是LDH，反映了以羥丁酸作為底物時的LDH1和LDH2的作用，其活力可持續14 d或更長時間[13]。本試驗中，1.50、15.00 mg/L As2O3暴露后，小鼠血清中AST、CK、LDH、HBDH的酶活力均顯著增加，表明砷暴露對小鼠心肌造成特異性損傷，且隨著染毒劑量的增加損傷程度加重。

3.2 砷暴露對小鼠心肌細胞凋亡的影響

細胞凋亡是嚴格受到細胞信號調控的自主性消亡的過程[14-15]。凋亡通路核心分子家族成員有2個：Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族成員中，有一類抑制凋亡的分子，以Bcl-2分子為代表[16]；還有一類促進凋亡發生的分子，以Bax分子為代表[17]。Caspase家族成員中，一類是凋亡啟動分子，包括Caspase-2、8、9、10；另一類是凋亡效應分子，包括Caspase-3、6、7；還有一類Caspase的亞家族分子和凋亡的關系不大[18]。SUN等[19]研究發現，As2O3可顯著抑制神經膠質瘤細胞抗凋亡基因Bcl-2的表達，并以時間依賴性方式上調凋亡基因Bax的表達，從而誘導細胞凋亡。

細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，從而切斷核小體間的DNA使其發生斷裂暴露3′-OH，因此，可利用TUNEL法來檢測細胞凋亡[20]。本試驗研究發現，不同濃度砷暴露組中均可見TUNEL陽性凋亡心肌細胞，高濃度砷暴露組凋亡心肌細胞的數量明顯增多。通過實時熒光定量PCR檢測Bax、Bcl-2以及Caspase-3 mRNA的表達，發現砷暴露上調了小鼠心肌組織中Bax及Caspase-3的表達，下調了Bcl-2的表達，表明亞慢性砷暴露可誘導小鼠心肌細胞發生凋亡。