玫煙色棒束孢IF-1106菌株液體培養條件優化

鄧 歡，高亞婷，田 晶

（呂梁學院生命科學系，山西呂梁033000）

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea），又稱為玫煙色擬青霉（Paecilomyces fumosoroseus），屬于子囊菌門肉座菌目蟲草菌科棒束孢屬[1]。它是一種寄生在昆蟲身上的真菌，在自然界中可寄生在鱗翅目、雙翅目、膜翅目等多種昆蟲上，具有廣泛的寄主范圍，可對多種昆蟲起致病作用[2-5]，尤其對刺吸式口器害蟲具有良好的致病性[6]，被廣泛用于生物防治[7]。

昆蟲病原真菌玫煙色棒束孢主要通過固體發酵和液體發酵進行一定的繁殖、生產加工并用于實際生活[8-9]。目前，國內外對玫煙色棒束孢的研究報道主要在生物學、致病力測定、致病機制、防治應用等方面[10-12]。在不同的培養條件下，菌株的菌絲生物量、產孢量存在一定的差異[13]，因此，研究玫煙色棒束孢菌株菌絲生物量及產孢量的培養條件，是利用菌株進行生物防治的基礎[14]。

本研究通過正交試驗，探究玫煙色棒束孢最適液體培養條件，以擴大培養該菌，為其工業化生產提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 玫煙色棒束孢IF-1106菌株，分離自山西省太谷縣溫室大棚中，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCNo.7514。

1.1.2 培養基 PDA培養基；液體條件基礎培養基：0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g KCl，1.0 g KH2PO4，0.1 g FeSO4·7H2O。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養方法 將玫煙色棒束孢IF-1106菌株試管斜面放置，保存在4℃冰箱中。在需要使用時，將其取出并在室溫下活化24 h，接種在PDA培養基上，并且25℃培養于霉菌培養箱中[15]。當菌株長滿培養皿的2/3時取出培養皿。

1.2.2 種子母液的制備 接種在PDA培養基上的菌株培養10 d后，用0.1%的吐溫-80無菌水稀釋，配制成孢子懸浮液[16]，并將孢子懸浮液的濃度調整為1×107cfu/mL。

1.2.3 菌絲生物量和產孢量的測定 在無菌條件下，將50 mL液體培養基加入到250 mL三角瓶中，按5%的接種量接入種子母液，在恒溫搖床上培養，7 d后在顯微鏡下用血球計數板測定孢子數；將濾紙烘干至恒質量，對菌絲進行過濾后用蒸餾水洗滌，在60℃烘箱中烘干，用電子天平稱質量[17]，測定菌絲生物量。

1.2.4 最適碳源和氮源組合的確定 以葡萄糖和蔗糖為碳源，蛋白胨和硝酸鈉為氮源，將碳源、氮源與基礎培養基組合，形成玫煙色棒束孢菌株液體培養的4種培養液，分別對菌株進行培養。根據其菌絲生物量和產孢量確定菌株生長的最適碳源和氮源，菌絲生物量和產孢量的測定方法同1.2.3。

1.2.5 單因素試驗 在確定最適碳源和氮源為蔗糖和蛋白胨后，對蔗糖質量分數、蛋白胨質量分數、培養時間3個因素分別進行單因素試驗。

1.2.5.1 蔗糖質量分數的確定 在0.2%的蛋白胨及基礎培養基中分別加入2%、3%、4%、5%、6%的蔗糖，每個質量分數重復3次，培養6 d后測定其菌絲生物量和產孢量，測定方法同1.2.3。

1.2.5.2 蛋白胨質量分數的確定 在5%的蔗糖及基礎培養基中分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的蛋白胨，每個質量分數重復3次，培養6 d后測定其菌絲生物量和產孢量，測定方法同1.2.3。

1.2.5.3 培養時間的確定 將5%的蔗糖、0.2%的蛋白胨及基礎培養基組合成培養液，置于25℃的培養箱中培養9 d，從第5天開始每隔24 h取3瓶培養液，測定其菌絲生物量和產孢量，測定方法同1.2.3。

1.2.6 正交試驗 根據單因素試驗結果，每個因素選取較佳的3個水平進行正交試驗，因素與水平列于表1。

1.3 數據分析

用SPSS17.0軟件計算試驗數據的平均值和標準誤，用Duncan新復極差法比較均值的差異顯著性。

表1 因素與水平

2 結果與分析

2.1 最適碳源和氮源組合結果

從圖1、2可以看出，不同的碳源和氮源組合的產孢量和菌絲生物量均不同，且差異顯著（P＜0.05）。當蔗糖、蛋白胨為碳源和氮源時，其菌絲生物量和產孢量均達最大值，分別為16.93 mg/mL和7.27×107cfu/mL。因此，蔗糖和蛋白胨為菌株的最適碳源和氮源。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 庶糖質量分數的確定 從圖3、4可以看出，蔗糖質量分數為5%時，菌絲生物量和產孢量均達最大值，分別為7.7mg/mL和6.67×107cfu/mL。當蔗糖質量分數低于或高于5%時，菌絲生物量和產孢量均降低。由于蔗糖質量分數為4%、5%、6%時，菌絲生物量和產孢量均較大，所以，選擇這3個蔗糖質量分數作為正交試驗的因素和水平。

2.2.2 蛋白胨質量分數的確定 由圖5、6可知，不同氮源條件下菌絲生物量及產孢量差異顯著（P＜0.05）。蛋白胨質量分數為0.5%時，菌絲生物量和產孢量差異性最顯著，均為最大值，分別為11 mg/mL和11.43×107cfu/mL。由于0.5%、1.0%、1.5%這3個蛋白胨質量分數較接近，所以，選擇這3個蛋白胨質量分數作為正交試驗的因素和水平。

2.2.3 培養時間的確定 由圖7、8可知，不同培養時間下菌絲生物量及產孢量差異明顯（P＜0.05）。隨著培養時間的增加，菌絲生物量及產孢量均呈上升趨勢，到第6 d時，菌絲生物量、產孢量達到最大值，分別為17.27 mg/mL和7.8×107cfu/mL，此后菌絲生物量及產孢量均又呈下降趨勢。由于5、6、7 d這3個培養時間較接近，所以，選擇這3個培養時間作為正交試驗的因素和水平。

2.3 正交試驗結果

表2 菌絲生物量正交試驗結果

從表2、3可以看出，影響玫煙色棒束孢的菌絲生物量和產孢量大小順序均為：培養時間＞氮源＞碳源。根據極差分析得出，菌絲生物量和產孢量的最優培養條件不完全一致，獲得最多菌絲生物量的最優組合為A2B3C2，即蔗糖質量分數5%、蛋白胨質量分數1.5%、培養時間6 d；獲得最多產孢量的最優組合為A1B1C3，即蔗糖質量分數4%、蛋白胨質量分數0.5%、培養時間7 d，以此為試驗條件得出產孢量為7.53×107cfu/mL。

表3 產孢量正交試驗結果

3 結論與討論

對玫煙色棒束孢IF-1106菌株而言，碳源選用蔗糖、氮源選用蛋白胨的培養基菌絲生物量和產孢量較大。通過正交試驗得出，對菌絲生物量和產孢量的影響因素排序均為培養時間＞氮源＞碳源，蔗糖質量分數5%、蛋白胨質量分數1.5%、培養時間6 d時，菌絲生物量最大；蔗糖質量分數4%、蛋白胨質量分數0.5%、培養時間7 d時，產孢量最大。

由結果可以得出，適合菌絲生長的碳、氮源質量分數和適合產孢的碳、氮源質量分數是不一致的，說明適合菌絲生長的培養基與適合產孢的培養基是不一致的[18]。當需要菌絲生物量多時，可以選用蔗糖質量分數為5%、蛋白胨質量分數為1.5%的培養基；當需要產孢量多，制備孢子粉時，可以選用蔗糖質量分數為4%、蛋白胨質量分數為0.5%的培養基。