重組雞細胞外脂肪酸結合蛋白的原核表達及鑒定

田志雄，李娜娜，盧曉曉，2，郭 敏，張 寧，李 欣，張 鼎，趙宇軍，閆 芳，高榮琨，寧官保，田文霞

（1.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801；2.溫縣農林局，河南溫縣454850；3.晉城市科學技術局，山西晉城048000）

包括脂肪酸（FAs）等在內的脂類是所有細胞的基本生化組成，具有多種生物學作用，即作為生物膜的結構成分、能量來源和一系列細胞調節功能等[1]。脂肪酸結合蛋白（FABPs）是一種質量較小的水溶性蛋白，迄今為止，已鑒定出12個FABP家族成員，其中，10個亞型也在人類中表達[2-3]。FABPs主要參與動物體內的脂肪酸代謝，具有調節基因轉錄的能力[4]。細胞外脂肪酸結合蛋白（Extracellular Fatty Acid-binding Protein，Ex-FABP）是一種雞胚發育過程中表達于肥大軟骨、肌肉纖維和血粒細胞中的脂蛋白，最初命名為Ch21，后來由于其結合特性而被重新命名為Ex-FABP[5]。這個低分子量蛋白屬于lipocalin家族，其家族共享相似的b-桶三級結構[6]。因此，細胞外脂肪酸結合蛋白與親脂性小分子物質（如類維生素A、脂肪酸、膽固醇、前列腺素、信息素和增香劑等）具有相同的功能[7]。有研究發現，胞外脂肪酸結合蛋白還具有控制細胞凋亡的功能[8]。

本試驗通過原核表達方法克隆雞Ex-FABP基因，將目的基因連接到克隆載體pGEM-TEasy上，然后與pET-28a（+）載體連接，并轉化到BL21（DE3）進行誘導表達蛋白，最后經鑒定得到Ex-FABP蛋白，旨在為后續進行動物體內試驗以及家禽疾病的研究提供一定理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

pET-28a載體由山西農業大學生物制品實驗室保存；Trizol、PCR聚合酶購自大連TaKaRa公司；DNA ladder、DNA loading buffer購自中科瑞泰生物有限公司；Agarose-G10購自Biowest公司；限制性核酸內切酶Eco RⅠ、XhoⅠ購自New England Biolabs公司；pGEM-TEasy克隆載體購自Promega公司；SDS、Glycine、Coomassie Blue Staining Solution和50×TAE緩沖液購自北京博奧拓達公司；Anti-6×His tag抗體購自Abcam公司；Carnamycin sulfate、SYBRGreen I核酸染料、氨芐青霉素、丙烯酰胺、Imidazole、甲叉丙烯酰胺、Ammoniumpersulphate、四甲基乙二胺、蛋白Marker、麗春紅、羊抗小鼠IgG二抗和NC膜購自Solarbio科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 按照NCBI中公布的雞Ex-FABP基因序列（AF121346.1），通過使用DNAMAN、Primer軟件設計引物，并在上下游引物添加酶切位點Eco RI和Xho I以及保護性堿基。

上游引物：5′-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCC GGA-3′；下游引物：5′-AGCTCTCGAGCTACACTTC ATCAAGCTGCAT-3′。

1.2.2 Ex-FABP基因克隆與鑒定 取雞的脛骨生長板，使用Trizol法提取RNA，反轉錄獲得cDNA，然后進行PCR擴增，通過凝膠電泳檢測結果，并回收目的條帶。

1.2.3 雞Ex-FABP重組表達質粒的構建與鑒定采用雙載體系統構建目的質粒，即首先將目的基因連接到克隆載體pGEM-TEasy上，獲得重組克隆質粒T-Ex-FABP；然后取適量重組克隆質粒T-Ex-FABP和表達質粒pET-28a（+）同時進行酶切，并檢測結果；用T4 DNA連接酶將Ex-FABP基因和pET-28a（+）載體連接，并轉化到BL21（DE3）感受態細胞，接于LB板上，通過Kana抗性選出陽性菌落進行PCR鑒定；將鑒定正確的菌液提取質粒，經雙酶切鑒定正確后進行測序分析，獲得表達載體pET-28a-Ex-FABP。

1.2.4 Ex-FABP重組蛋白的誘導表達及條件優化將重組質粒pET-28a-Ex-FABP轉入到BL21（DE3），接種到含Kana的LB板上，37℃培養12 h；隨機挑取單菌落于含Kana的LB培養基，當OD600為0.5～0.7時添加IPTG誘導；誘導結束后進行細菌破碎，12 000 r/min 4℃離心30 min，然后分別通過SDSPAGE鑒定沉淀或上清中蛋白表達情況。

鑒定蛋白表達形式后，菌液繼續進行分組誘導培養，以摸索誘導表達的最佳條件。分別從IPTG濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）、誘導溫度（25、30、37℃）、誘導時間（6、12、21 h）3個方面來檢測誘導條件對Ex-FABP表達的影響。

1.2.5 Ex-FABP重組蛋白的純化 以最佳的誘導條件繼續進行誘導表達，之后收集菌體，PBS洗菌3次，使用超聲波裂解破碎細菌，吸取上清，用無菌濾器過濾。本試驗選擇的載體為pET-28a（+），攜帶有His標簽，可直接進行鎳柱層析法純化蛋白。將無菌過濾的樣品與Binding Buffer等比例混合上柱，分別用不同濃度（10、20、30、40 mmol/L）的咪唑洗雜，用500 mmol/L的咪唑沖洗Ex-FABP蛋白，收集Ex-FABP蛋白，通過SDS-PAGE鑒定結果。

1.2.6 Western Blot鑒定Ex-FABP重組蛋白 SDSPAGE電泳后轉膜，用麗春紅染色，再用蒸餾水洗脫，脫色后的膜加入TBST稀釋的5%脫脂奶粉進行封閉；加入用1∶1 000稀釋的Anti-6×His tag抗體，4℃孵育4 h；回收抗體后用TBST洗滌3次；再加入用TBST按1∶5 000稀釋的IgG抗體，37℃搖動孵育1 h；TBST洗滌后取出NC膜，將ECL發光液均勻覆蓋于膜表面，放入暗盒中觀察，掃描記錄結果。

2 結果與分析

2.1 目的基因PCR擴增結果

預期的Ex-FABP基因大小為495 bp，在500 bp左右出現條帶（圖1），表明擴增得到了目的基因Ex-FABP。

2.2 重組克隆質粒T-Ex-FABP的序列測定結果

菌液PCR結果顯示，在500 bp左右出現特異性條帶（圖2），提取質粒后送上海美吉生物公司進行測序，結果顯示，序列同源性為99%，表明重組克隆質粒構建成功。

2.3 p ET-28a-Ex-FABP表達載體的鑒定

重組表達質粒用Eco RⅠ和XhoⅠ同時酶切后進行鑒定，可見相應的2條電泳帶（圖3），并且Ex-FABP基因在500 bp左右位置，序列經過分析后完全正確，證明重組pET-28a-Ex-FABP質粒連接成功；同時空質粒pET-28a也進行雙酶切，結果顯示，有相應的一條帶（圖3）。

2.4 Ex-FABP重組蛋白的誘導表達及條件優化

2.4.1 Ex-FABP重組蛋白的誘導表達 將重組載體轉入BL21（DE3），得到含有目的基因的BL21/Ex-FABP，誘導表達后進行SDS-PAGE鑒定，加上His標簽后Ex-FABP蛋白大約是24 ku，結果顯示，誘導后菌液在20.1～31.0 ku有一條帶；未誘導菌液在相同位置無條帶（圖4）。并且，Ex-FABP重組蛋白在上清和沉淀中均有分布，取同等上樣量進行檢測發現，上清中蛋白表達量遠高于沉淀（圖5）。

2.4.2 Ex-FABP重組蛋白表達的條件優化 利用SDS-PAGE對蛋白表達的IPTG濃度、誘導溫度及誘導時間進行檢測，結果顯示，0.2 mmol/L IPTG、30℃、21 h為Ex-FABP重組蛋白表達的最佳條件（圖6～8）。

2.5 Ex-FABP重組蛋白的純化及鑒定

2.5.1 Ex-FABP重組蛋白的純化 Ex-FABP重組蛋白的裂解液上清經純化后，用500 mmol/L的咪唑沖洗，可得到較純的目的蛋白（圖9）。

2.5.2 Ex-FABP重組蛋白的免疫印跡鑒定結果由圖10可知，通過Western Blot鑒定純化后，上清中出現單一特異性條帶，即純化得到目的蛋白Ex-FABP；而未誘導菌液中無條帶。

3 結論與討論

脂肪酸結合蛋白（FABPs）是一類與配體相關的水溶性蛋白，其大小為14～15 ku，在與高代謝活性和脂質存儲相關的組織中大量表達，迄今為止，已鑒定出12個FABP家族成員[9-10]。盡管最初是根據首次描述FABP表達的組織類型命名，但是后來發現有些FABP成員在多個組織中都有表達，并且可以共同表達。雖然FABP家族成員只表現一定的序列同源性，但是不同家族成員之間的三級蛋白質結構基本相似，由10條反平行的β鏈組成，形成β桶結構[3]。FABP表達的失調可能是通過基因突變或環境生活方式的影響而發生。近年來，FABP在腫瘤生物學中的作用越來越多地被報道，外源性FABP的表達升高與腫瘤的進展和侵襲性有關，但內源性FABP過表達的作用還有待進一步研究。

Ex-FABP是一類不含甘露糖的蛋白質，具有鏈內二硫鍵構象，可抵抗有限的胃蛋白酶消化[11]。BEDARD等[12]也發現了相同的蛋白，分泌于雞胚成纖維細胞和雞心臟間充質細胞，稱為p20K蛋白。ExFABP和p20K都是禽類蛋白，在其他物種特別是小鼠和人中還沒有明確的同源性。在分化軟骨和肌管時，炎癥因子（脂多糖等）明顯上調Ex-FABP蛋白合成；而抗炎藥抑制生理表達的蛋白合成，并且阻止脂多糖誘導的蛋白合成[13]，表明Ex-FABP可能在肌管分化和成熟過程中發揮反饋（自分泌）控制作用，并可能在維持細胞活力方面發揮作用[14]。本試驗通過引物設計獲取雞Ex-FABP基因，并連接到質粒pET-28a（+）上，轉化至BL21（DE3）進行培養，摸索最佳誘導條件，表達了大量純度比較高的Ex-FABP蛋白，結果為后續的動物試驗以及家禽疾病的研究提供了依據。

本試驗選擇的是原核表達體系，其可以快速得到大量的目的蛋白，而且所需的成本比較低，方法也比較簡單，可以表達的蛋白也比較多[15]。缺點在于表達出來的蛋白沒有經過修飾，不一定有天然的活性[16]，且無法調控水平和時間，蛋白經常存在于包涵體中，導致產物純化困難。真核表達系統雖然可以進行相應的修飾，但是周期較長，速度慢，獲得的蛋白產量低。本試驗采用的是原核表達系統，但是Ex-FABP為真核基因，所以后期還需要進行加工修飾，即表達出的蛋白需經過透析等過程，使蛋白具有功能活性。

在原核體系中，最常用的宿主菌為大腸桿菌，其具有背景明確、快速便捷、產量較高的優點[17-18]。目前，在大腸桿菌表達體系中，最常用的質粒有pET、pGEX等。這2種系列表達質粒均帶有純化標簽，即His標簽和GST標簽[19]。而由于His標簽具有分子量小、免疫原性低、無需處理即可進行動物體內試驗等特點，以及考慮到本試驗的下游試驗所需蛋白要求，故選用了存在His標簽的pET-28a（+）質粒。而且選擇pET系統表達蛋白時，如果不添加誘導劑，誘導表達過程幾乎不進行。本試驗根據pET-28a（+）的質粒圖譜，在引物設計時選擇Eco RⅠ和XhoⅠ限制性內切酶，使Ex-FABP基因可以順利連接到pET-28a（+）載體上，并且本試驗選用了適合pET表達載體的BL21（DE3）菌株作為宿主菌。

為了得到大量的重組Ex-FABP蛋白，本試驗還對IPTG濃度、誘導溫度及時間進行了分組測定，結果得出，IPTG濃度對試驗沒有較大影響；溫度為30℃時的表達量要高于25、37℃；誘導時間為21 h時蛋白表達量高于6、12h。即IPTG終濃度0.2mmol/L、誘導溫度30℃、誘導時間21 h為Ex-FABP蛋白表達的最佳誘導條件。

本試驗成功構建了重組質粒pET-28a-Ex-FABP，并對重組Ex-FABP蛋白進行了純化、SDS-PAGE和Western Blot鑒定，得到了純度較高的重組蛋白，構建了一套雞Ex-FABP蛋白的表達程序，結果可為后續的動物試驗以及家禽疾病的研究提供理論依據。