特發性膜性腎病腎組織中足細胞數目減少與α3β1整合素關系

雷靜，蘇曉曉，張蓓茹，何平，周華

無明顯誘因的膜性腎病稱為特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)，其是腎病綜合征和原發性腎小球疾病的常見原因。近年來IMN在原發性腎小球疾病中的構成比明顯增多[1]。IMN是一種非炎性自身免疫性腎病，其病理特征為存在上皮下免疫復合物，通過光學顯微鏡觀察到腎小球基底膜彌漫性增厚，以及通過免疫熒光發現沿著腎小球毛細血管環周邊的IgG和補體顆粒沉積。IMN的病因為上皮下原位免疫復合物沉積，C5b-9形成，插入足細胞中。足細胞通過合成腎小球基底膜(GBM)的組成部分、狹縫隔膜，參與保持內皮細胞的穩定性來維持腎小球濾過率及GBM的完整性[2]。而足細胞凋亡是IMN進展中的關鍵步驟。整合素是腎小球濾過膜與足細胞的主要黏附分子，在調控細胞生存中起到重要作用，狹縫隔膜是限制蛋白質濾過最重要的屏障，而ɑ3β1整合素是連接足細胞和狹縫隔膜的重要組成成分，也是維持足細胞抵抗濾過壓力的重要組成部分。目前對于整合素介導的足細胞生存在許多疾病中均有研究[3-4]，但對于整合素與特發性膜性腎病中足細胞的關系鮮見報道。本研究探討IMN中足細胞的減少與整合素ɑ3β1的關系，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)腎組織: 采集2016年2月—2017年3月中國醫科大學附屬盛京醫院腎內科經臨床和腎活檢確診的IMN住院患者30例的活檢腎組織石蠟切片(病例組)，排除糖尿病、腫瘤、系統性紅斑狼瘡等疾病引起的膜性腎病。其中男19例，女11例； 年齡28～66歲，中位數48.7歲。 同期于本院泌尿外科行腎臟腫瘤手術患者30例，采取遠離腫瘤的正常區域腎組織(對照組)，制作石蠟切片，其中男23例，女7例；年齡31～72歲，中位數54.5歲。(2)試劑：腎母細胞瘤抑制基因1(Wilms' tumor suppressor gene，WT1)兔抗人單克隆抗體(北京中杉金橋公司)；整合素ɑ3、整合素β1兔抗多克隆抗體(abcam公司)；免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑(北京中杉金橋公司)。(3)儀器： Nis-Elements F 3.0(日本)圖像采集軟件、圖像分析軟件； Nikon E 800(日本)顯微鏡。

1.2 觀測指標與方法

1.2.1 腎小球足細胞WT1表達檢測： WT1抗原在腎小球足細胞核表達，在其余腎組織中不表達，因此可用來評估腎小球足細胞數量。采用免疫組化方法對足細胞進行特異性染色。對2種腎組織石蠟切片脫蠟至水，于檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液中進行微波抗原修復7.5 min，室溫自然冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗片，滴加3% H2O2室溫孵育40 min，PBS洗片，正常羊血清室溫封閉40 min，PBS洗片，滴加抗WT1單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，次日室溫復溫20 min，PBS洗片，滴加二抗，室溫孵育25 min，PBS洗片，滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液20 min，PBS洗片，DAB顯色，蘇木素復染，流水返藍，脫水透明后用中性樹脂封片、觀察，細胞核染色為棕褐色者為足細胞。以PBS取代一抗作為陰性對照。

1.2.2 腎小球足細胞相對密度計算：按如下公式計算，Dpodo =Npodo/GRoi ×△S ×106(Cells/μm2)[13],Npodo為每個腎小球足細胞絕對數目，GRoi 為Nis-Elements Br-3.0分析軟件所選感興趣區域的面積，即腎小球的相對面積。于400倍顯微鏡下測量圖像的長和寬，計算出圖像框的實際面積A(μm2)，Nis-Elements Br-3.0分析軟件的“免疫組化自動分析模塊”測量圖像框的統計框總面積R(μm2)。△S =A/R，經計算400倍圖像△S =0.006 729 μm2。

1.2.3 腎小球足細胞ɑ3β1整合素表達檢測：采用免疫組化方法檢測。通過Nis-Elements Br-3.0軟件分析ɑ3β1整合素表達的平均光密度值并進行免疫組化半定量分析。具體步驟除每張切片滴加α3多克隆抗體(濃度1∶1 500)或β1多克隆抗體(濃度1∶1 500)外，其他同WT1表達檢測。

2 結 果

2.1 2組足細胞絕對數目及相對密度比較 病例組患者單位腎小球足細胞絕對數目(Npodo)及相對密度(Nv)均低于對照組(P均<0.05)，見表1、圖1。

2.2 2組腎小球ɑ3β1整合素表達比較 病例組腎小球ɑ3β1整合素表達的平均光密度值(2 795.33±3 999.97)較對照組(7 031.94±8 702.80)降低(t/P=2.423/0.020)，見圖2。

表1 2 組腎組織足細胞數目及密度比較

圖1 WT1 標記足細胞核的腎小球病理表現

圖2 腎小球ɑ3β1整合素表達變化

2.3 足細胞與ɑ3β1整合素及腎功能相關性分析 Pearson相關分析顯示，足細胞絕對數和相對密度分別與ɑ3β1整合素呈正相關,即隨著整合素表達升高，足細胞絕對數目、相對密度均升高，與24 h尿蛋白呈負相關，即隨IMN患者足細胞絕對數和相對密度降低，24 h尿蛋白升高；足細胞絕對數和相對密度與肌酐、白蛋白未見顯著相關(P>0.05)，見表2。

表2 IMN患者足細胞數量與ɑ3β1整合素及腎功能相關性

3 討 論

膜性腎病是成人腎病綜合征腎活檢診斷中最常見的疾病類型，如果未經治療，約1/3可自發緩解，特別是抗PLA2R水平不足或較低的患者，10年內進展終末期腎病(ESRD)的患者約占1/3，其余患者發展為非進展性慢性腎病(CKD)，因此對診斷為膜性腎病的患者進行積極干預治療非常重要。在IMN中[5]，沉積物處于上皮下位置，直接與足細胞的足突相鄰，免疫介導的疾病可損傷足細胞，而足細胞減少也是IMN進展的關鍵。足細胞作為構成濾過膜的重要組成成分，其數目減少可導致腎小球濾過膜損傷，反過來也加速了足細胞的丟失，導致IMN的進展。

本實驗通過用WT1標記足細胞核來檢測病例組與對照組腎組織切片的足細胞絕對數目，計算其相對密度，結果顯示，病例組足細胞絕對數目、相對密度均較對照組降低。尚瑜等[6]分析了36例MN患者，發現腎組織中足細胞數目明顯減少，與此實驗結果一致。且尚瑜等[7]通過測量IMN患者尿中足細胞數，結果顯示，Ⅱ期和Ⅲ期膜性腎病患者尿足細胞數較Ⅰ期膜性腎病患者明顯減少,表明足細胞在發病初期從尿中丟失最為明顯。足細胞是一種特異性的終末分化細胞，是不可再生細胞。導致足細胞凋亡的可能因素有：(1)細胞的應激狀態，如氧化應激和內質網應激，促使RAAS系統所致的足細胞損傷[8]，其中醛固酮可通過鈣皮質激素受體(MR)來介導足細胞損傷[9]，同時醛固酮還增加C末端Src激酶(Csk)的表達，誘導足細胞凋亡[10]。(2)若患者合并高血糖，也可通過誘導活性氧產生而引起足細胞凋亡[11]。(3)內質網中積累的未折疊蛋白導致的細胞壓力稱為內質網應激，而長期或持續的內質網應激可能具有細胞毒性，導致足細胞凋亡[9]。(4)各種細胞因子也參與足細胞的凋亡， 轉化生長因子-β1在足細胞中可誘導特定的信號通路，參與足細胞的存活和凋亡平衡[12]。腫瘤壞死因子-α被認為參與足細胞凋亡，但其機制尚不完全清楚[13]。

蛋白尿的產生與腎小球濾過屏障密切相關，濾過屏障主要由毛細血管內皮細胞、基底膜及足細胞構成，腎小球毛細血管內皮細胞屬于有孔內皮細胞，其窗孔只有一層帶負電荷酸性糖蛋白組成的細胞衣覆蓋，可阻止白蛋白等大分子通過。足細胞的突起相互交織，在這些足突之間覆有一層裂孔隔膜。而且，足細胞足突中的細胞骨架與細胞內的相關蛋白相互作用，維持濾過屏障的完整性。本實驗驗證了IMN患者足細胞與白蛋白、肌酐及24 h尿蛋白的關系，結果表明，足細胞絕對數目、相對密度與白蛋白無明顯相關性，這可能與IMN患者濾過屏障破壞使得白蛋白丟失過多有關，而測量的足細胞數是腎穿刺時腎組織僅存的足細胞。且足細胞絕對數目、相對密度與肌酐無明顯相關性，但隨著腎組織中足細胞絕對數目與相對密度的降低，尿蛋白逐漸增多。既往有研究表明[7]，IMN患者尿中足細胞數與24 h尿蛋白呈負相關。目前研究認為，足細胞足突中的肌動蛋白細胞骨架結構改變，繼而發生隔膜蛋白改變出現蛋白尿[14]，隨著蛋白尿的進一步加重，又反過來繼續損害足細胞，造成濾過屏障進一步破壞。因此，足細胞損傷或耗竭在蛋白尿的發生中起關鍵作用。

整合素是異質二聚體的穿膜蛋白，由ɑ和β亞基組成，它們是細胞與細胞外基質黏附的受體。足細胞主要經ɑ3β1整合素錨定在GBM上。在本研究中，病例組整合素的總表達量明顯低于對照組。ɑ3β1整合素對維持濾過屏障結構完整性有重要作用。ɑ3β1介導足細胞黏附于GBM的Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白上，其表達改變會使足細胞與GBM的黏附性下降，導致足細胞脫落。敲除ɑ3基因，動物在出生時死亡，發現其腎小球中足細胞完全脫落，而敲除β1后，動物出生后出現大量蛋白尿，同時發現足細胞丟失。而其中涉及機制可能為，ɑ3β1通過下調 Bax/Bcl-2、蛋白激酶C通路阻止足細胞凋亡和脫落[15]。

因此，腎組織切片中足細胞絕對數目及相對密度可用于輔助評價IMN患者病情嚴重程度。同時，也應該同時監測尿液中足細胞數目的變化，進一步證實足細胞在膜性腎病進展中的作用。目前對于IMN患者腎組織中足細胞與整合素、PLA2抗體等研究及足細胞與患者的臨床、病理指標等研究較少，還需大量的循證醫學證據深入探究足細胞在膜性腎病中的作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

雷靜：實施研究過程，數據收集，分析整理，設計論文框架，撰寫論文；蘇曉曉：進行文獻調研與整理；張蓓茹：協助修訂論文；何平：研究選題，設計研究方案、研究流程，修訂論文，論文終審；周華：提出研究方向